تحضير عينة محاصرة بتعليق البروتين للبروتينات المسيل للدموع بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة - قياس الطيف الكتلي الترادفي

قدم الأشخاص موافقة خطية مستنيرة قبل المشاركة في الدراسة. تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات الإنسان بجامعة هونغ كونغ للفنون التطبيقية والتزمت بمبادئ إعلان هلسنكي. 1. جمع السائل المسيل للدموع البشري مع شريط شيرمر ارتد القفازات وعقم لتجنب تلوث العينات. تأكد من أن العبوة الداخلية سليمة ومعقمة وغير منتهية الصلاحية. ثني الجزء العلوي من شريط شيرمر إلى الداخل قليلا عند علامة 0 مم ، كما هو موضح بالقرب من طرف نصف دائرة الشريط (الشكل 1). قم بإزالة الشريط من العبوة الداخلية عن طريق الضغط على نهاية الشريط ، وتجنب الاتصال المباشر بمنطقة جمع العينات من 0 إلى 25 مم. اطلب من الموضوع أن ينظر بعيدا عن موضع الشريط المراد وضعه. اسحب الجفن السفلي لأسفل برفق واربط نهاية الشريط في الجزء السفلي بالقرب من منطقة canthus الجانبية (الشكل 2). كرر نفس الإجراء على العين الأخرى. اطلب من الشخص إغلاق الجفون برفق لتقليل التهيج. جمع السائل المسيل للدموع لمدة 5 دقائق أو يفضل جمع عينة المسيل للدموع 15-20 ملم. اطلب من الشخص فتح كلتا العينين ، واسحب الجفن السفلي برفق وأزل الشرائط من الموضوع. افحص الطول المائي على شريط شيرمر وسجل الكمية المجمعة بالملليمتر. جفف الشريط باستخدام سخان إطار قياسي ونظيف حتى يجف السائل تماما.ملاحظة: يجب تجنب التسخين الزائد الذي قد يؤدي إلى تفحم ورق الترشيح. أدخل كل شريط شيرمر مجفف في أنبوب تبريد مكتوب عليه وقم بتخزينه بشكل مفضل في مكان بارد وجاف في الظلام حتى تتم معالجته مرة أخرى. 2. تحضير المواد الكيميائية والكواشف المخزن المؤقت للتحلل (5٪ SDS ، 50 مللي متر TEAB ، درجة الحموضة 7.5) ، 20 ملماصة 1 مل من 1 M TEAB و 80 ميكرولتر من حمض الفوسفوريك 12٪. دوامة و sonicate لفترة وجيزة لإزالة فقاعات. قم بتعبئة ما يصل إلى 20 مل بالماء منزوع الأيونات. تزن 1 غرام من SDS وتضاف إلى الحل مع التذبذب حتى يذوب. عازلة لترسيب البروتين (90٪ ميثانول ، 100 مللي متر TEAB ، درجة حموضة 7.1) ، 10 ملأضف 893 ميكرولتر من 1 M TEAB و 92 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات. أضف 15 ميكرولتر من 85 وزن٪ حمض الفوسفوريك و 9 مل من الميثانول إلى المحلول والدوامة لفترة وجيزة. محلول الهضم (50 مللي متر TEAB) ، 1 ملأضف 50 ميكرولتر من 1 متر TEAB وقم بتعبئة ما يصل إلى 1 مل بالماء منزوع الأيونات. محلول ديثيوثريتول (DTT) 200 مللي متر ، 500 ميكرولترتزن 15 ملغ من DTT وتذوب في 500 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ؛ دوامة لفترة وجيزة.ملاحظة: التحضير قبل الاستخدام. محلول يودوأسيتاميد (IAA) 400 مللي متر ، 200 ميكرولترتزن 15 ملغ من IAA وتذوب في 200 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات ؛ دوامة لفترة وجيزة. ملاحظة: استعد قبل الاستخدام وتجنب الضوء. 0.2٪ حمض الفورميك ، 50٪ أسيتونيتريل ، 10 ملتحضير 10 مل من 50 ٪ أسيتونيتريل في الماء منزوع الأيونات. أضف 20 ميكرولتر من حمض الفورميك والدوامة لفترة وجيزة. 0.2٪ محلول حمض الفورميك ، 10 ملأضف 20 ميكرولتر من حمض الفورميك إلى 10 مل من الماء منزوع الأيونات والدوامة لفترة وجيزة. 0.1٪ محلول حمض الفورميك ، 10 ملأضف 10 ميكرولتر من حمض الفورميك إلى 10 مل من الماء منزوع الأيونات ؛ دوامة لفترة وجيزة. 3. استخراج البروتين في شريط شيرمر قم بقص وتجاهل الواجهة الأمامية بعد علامة 0 مم للشريط لإزالة التلوث المحتمل بسبب ملامسة أنسجة الملتحمة بمقص نظيف من الفولاذ المقاوم للصدأ. قطع الشريط على فترات 1 مم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل (الشكل 3). أضف 100 ميكرولتر من محلول التحلل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، ودوامة عند 1000 دورة في الدقيقة ، ودرجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في خلاط حراري. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 1.5 مل. حرك الشرائط إلى أطراف ماصة سعة 200 ميكرولتر باستخدام ملقط نظيف. ضع الأطراف في نفس الأنبوب من الخطوة 3.4 مع الحامل وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 4000 × جم لمدة 1 دقيقة أخرى لتحقيق أقصى قدر من استرداد العينة المتبقية على الشريط. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام حمض البيسينتشونينيك (BCA) أو مقايسة البروتين المتوافقة. 4. إعداد عينة محاصرة التعليق تطبيع العينات إلى 50 ميكروغرام من البروتين بناء على نتيجة فحص البروتين. أضف 200 mM DTT بنسبة 1:10 (v / v ، DTT: عينة) إلى تركيز نهائي قدره 20 mM DTT واحتضانها عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. يبرد محلول البروتين إلى درجة حرارة الغرفة. أضف 400 mM IAA بنسبة 1:10 (v / v ، IAA: عينة) إلى تركيز نهائي قدره 40 mM IAA واحتضانها في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. أضف 12٪ حمض الفوسفوريك المائي بنسبة 1:10 (v / v ، الحمض: عينة) إلى تركيز نهائي قدره 1.2٪ حمض الفوسفوريك والدوامة لفترة وجيزة. أضف المخزن المؤقت لربط البروتين بنسبة 1: 6 (v / v ، العينة: buffer) والدوامة لفترة وجيزة.ملاحظة: في هذه الخطوة ، يجب تكوين جسيمات البروتين الغروية ، وسيظهر المحلول شفافا إذا كانت كمية البروتين كافية. قم بفك غطاء عمود الدوران الصغير لمحاصرة التعليق وقم بتجميع عمود الدوران على أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 مل لجمع التدفق. أضف ما يصل إلى 200 ميكرولتر من خليط تحلل البروتين المحمض في العمود. أجهزة الطرد المركزي العمود في 4000 × غرام لمدة 20 ثانية. كانت جسيمات البروتين محاصرة. كرر حتى يتم تحميل العينات إلى العمود. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت لربط البروتين وأجهزة الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 20 ثانية لغسل البروتين العالق. كرر 3x. قم بتجميع العمود الصغير لمحاصرة التعليق على أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. أضف 20 ميكرولتر من محلول الهضم TEAB 50mM الذي يحتوي على البروتياز بنسبة 1:25 (وزن / وزن ، التربسين: البروتين) على المرشح داخل عمود الدوران ، وتجنب الفقاعات وفجوة الهواء بين المرشح ومحلول الهضم. قم بتغطية عمود الدوران الصغير الذي يحبس التعليق لمنع التبخر. احتضان عند 47 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في خلاط حراري ؛ لا تهز أو دوامة أثناء الهضم. الببتيدات Elute مع 40 ميكرولتر من 50 mM TEAB بواسطة قوة الطرد المركزي عند 4000 × جم لمدة 20 ثانية. أضف 40 ميكرولتر من 0.2٪ FA وأجهزة طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 20 ثانية. أضف 35 ميكرولتر من 0.2٪ FA و 50٪ أسيتونيتريل وأجهزة طرد مركزي عند 4000 × جم لمدة 20 ثانية. حمام السباحة ثلاثة يشطف ويجفف مع جهاز طرد مركزي فراغ. يخزن في الفريزر بدرجة حرارة منخفضة للغاية -80 درجة مئوية حتى إجراء مزيد من التحليل. ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. 5. إعادة تكوين الببتيدات لتحليل قياس الطيف الكتلي أعد تكوين العينة ب 12 ميكرولتر من 0.1٪ FA ، دوامة ، وأجهزة طرد مركزي لفترة وجيزة. قم بقياس تركيز الببتيد باستخدام مجموعة فحص الببتيد. تطبيع تركيز الببتيد إلى 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر في 0.1٪ FA. انقل خليط الببتيد إلى قارورة أخذ العينات الأوتوماتيكية وجاهز لتحليل قياس الطيف الكتلي. 6. الحصول على عينة بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة – قياس الطيف الكتلي الترادفي قم بتحميل 3 ميكروغرام من الببتيد مع مخزن تحميل متساوي (0.1٪ FA ، 5٪ ACN) إلى عمود مصيدة (C18 ، 5 ميكرومتر ، 100 ميكرومتر ، 20 مم) بمعدل تدفق 2 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة. تجزئة الببتيدات باستخدام عمود تحليلي نانوي عكسي الطور (C18 ، 5 ميكرومتر ، 100 ميكرومتر ، 300 مم) بمعدل تدفق 350 nL / min في تدرج فصل 155 دقيقة. استخدم المرحلة المتنقلة A التي تتكون من خليط من 0.1٪ حمض الفورميك (v / v) ، و 5٪ ACN (v / v) في الماء والمرحلة المتنقلة B التي تحتوي على 0.1٪ FA (v / v) ، 98٪ ACN (v / v) في الماء. استخدم التدرج التالي: 0-0.5 دقيقة: 5٪ ب ، 0.5-90 دقيقة: 10٪ ب ، 90-120 دقيقة: 20٪ ب ، 120-130 دقيقة: 28٪ ب ، 130-135 دقيقة: 45٪ ب ، 135-141 دقيقة: 80٪ ب ، 141-155 دقيقة: 5٪ ب. قم بإجراء الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) باستخدام نطاق فحص TOF-MS بين 350 إلى 1800 م / ز مع وقت تراكم يبلغ 250 مللي ثانية ووقت استبعاد هدف ديناميكي يبلغ 18 ثانية. بعد ذلك ، قم بإجراء مسح MS / MS عند 100 إلى 1800 م / ز في وضع الحساسية العالية مع وقت تراكم يبلغ 50 مللي ثانية لأفضل 50 سلائف لكل دورة مع عتبة 125 cps لإشارة MS / MS مع حالة شحن من +2 إلى +4. قم بتحليل البيانات الأولية باستخدام البرامج المشار إليها أو المحركات المتوافقة الأخرى باستخدام قاعدة بيانات مرجعية في FASTA من قاعدة بيانات UniProt المتاحة للجمهور.