הכנת דגימה ללכידת תרחיף חלבונים עבור פרוטאומיקה של דמעות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם

הנבדקים סיפקו הסכמה מדעת בכתב לפני השתתפותם במחקר. המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה האנושית של האוניברסיטה הפוליטכנית של הונג קונג ודבק בעקרונות הצהרת הלסינקי. 1. איסוף נוזל דמעות אנושי עם רצועת שירמר יש ללבוש כפפות ולחטא כדי למנוע זיהום דגימה. בדקו שהאריזה הפנימית שלמה, סטרילית ולא פג תוקפה. כופפו מעט את החלק העליון של רצועת שירמר פנימה בסימן 0 מ”מ, כפי שמצוין ליד קצה חצי העיגול של הרצועה (איור 1). הסר את הרצועה מהחבילה הפנימית על ידי החזקת קצה הרצועה, והימנע ממגע ישיר עם אזור איסוף הדגימה מ- 0 עד 25 מ”מ. בקש מהנבדק להסיט את מבטו ממיקום הרצועה שיש למקם. משכו מטה את העפעף התחתון בעדינות וחברו את קצה הרצועה בפורניקס התחתון ליד אזור הקנטוס הצידי (איור 2). חזור על אותו הליך בעין השנייה. בקשו מהנבדק לסגור בעדינות את העפעפיים כדי למזער גירוי. יש לאסוף נוזל דמעות למשך כ-5 דקות או רצוי דגימת דמעות בקוטר 15-20 מ”מ. בקשו מהנבדק לפקוח את שתי העיניים, משכו מטה את העפעף התחתון בעדינות והסירו את הרצועות מהנושא. בדוק את אורך הלחות ברצועת שירמר ורשום את הכמות שנאספה במ”מ. יבשו את הרצועה עם מחמם מסגרת אחיד ונקי עד שהנוזל יבש לחלוטין.הערה: יש להימנע מחימום עודף שעלול לחרוך את נייר הפילטר. הכניסו כל רצועת שירמר מיובשת לצינור קריו-צינור מסומן ואחסנו אותה במקום קריר ויבש בחושך עד לעיבוד נוסף. 2. הכנת כימיקלים וריאגנטים חיץ ליזיס (5% SDS, 50 mM TEAB, pH 7.5), 20 מ”לפיפטה 1 מ”ל של 1 M TEAB ו 80 μL של 12% חומצה זרחתית. מערבלים וסוניק לזמן קצר כדי להסיר בועות. למעלה עד 20 מ”ל עם מים deionized. שוקלים 1 גרם SDS ומוסיפים לתמיסה עם תנודה עד להמסה. מאגר משקעים חלבוני (90% מתנול, 100 mM TEAB, pH 7.1), 10 מ”להוסף 893 μL של 1 M TEAB ו 92 μL של מים deionized. הוסף 15 μL של 85 wt. % חומצה זרחתית ו 9 מ”ל של מתנול לתמיסה מערבולת לזמן קצר. חיץ עיכול (50 מ”מ TEAB), 1 מ”להוסף 50 μL של 1 M TEAB וממלא עד 1 מ”ל עם מים נטולי יונים. 200 mM dithiothreitol (DTT) פתרון, 500 μLשוקלים 15 מ”ג של DTT ומתמוססים ב 500 μL של מים deionized; מערבולת בקצרה.הערה: יש להכין לפני השימוש. תמיסת יודואצטמיד (IAA) 400 mM, 200 מיקרוליטרשוקלים 15 מ”ג של IAA ומתמוססים ב 200 מיקרוליטר של מים נטולי יונים; מערבולת בקצרה. הערה: יש להכין לפני השימוש ולהימנע מאור. 0.2% חומצה פורמית, 50% אצטוניטריל, 10 מ”ללהכין 10 מ”ל של 50% acetonitrile במים deionized. מוסיפים 20 μL של חומצה פורמית ומערבולת לזמן קצר. 0.2% תמיסת חומצה פורמית, 10 מ”להוסף 20 μL של חומצה פורמית ל 10 מ”ל של מים deionized מערבולת לזמן קצר. 0.1% תמיסת חומצה פורמית, 10 מ”להוסף 10 μL של חומצה פורמית ל 10 מ”ל של מים deionized; מערבולת בקצרה. 3. מיצוי חלבון ברצועת שירמר גזור והשלך את הקצה הקדמי מעבר לסימן 0 מ”מ של הרצועה כדי להסיר זיהום פוטנציאלי עקב מגע של רקמות הלחמית עם מספריים נקיים מנירוסטה. חתכו את הרצועה במרווחים של 1 מ”מ לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ”ל (איור 3). הוסיפו 100 מיקרוליטר של חיץ ליזיס לצינור המיקרוצנטריפוגה, ומערבלים ב-1,000 סל”ד, טמפרטורת החדר למשך שעה בתרמומיקסר. צנטריפוגה לזמן קצר ולהעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 1.5 מ”ל. מעבירים את הרצועות לקצוות פיפטה של 200 μL בעזרת מלקחיים נקיים. הכניסו את הקצוות לאותו צינור משלב 3.4 עם מחזיק וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב-4,000 × גרם למשך דקה אחת נוספת להתאוששות מרבית של הדגימה הנותרת ברצועה. יש למדוד את ריכוז החלבון באמצעות חומצה ביכומונית (BCA) או בדיקת חלבון תואם. 4. הכנת דגימת לכידת מתלים נרמל דגימות ל 50 מיקרוגרם של חלבון בהתבסס על תוצאת בדיקת החלבון. הוסף DTT של 200 mM ביחס של 1:10 (v/v, DTT: sample) לריכוז סופי של 20 mM DTT ודגור ב- 95 ° C למשך 10 דקות. מצננים את תמיסת החלבון לטמפרטורת החדר. הוסף 400 mM IAA ביחס של 1:10 (v/v, IAA: מדגם) לריכוז סופי של 40 mM IAA ודגור בחושך בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. הוסף 12% חומצה זרחתית מימית ביחס של 1:10 (v/v, חומצה: דגימה) לריכוז סופי של 1.2% חומצה זרחתית ומערבולת לזמן קצר. הוסף חיץ קשירת חלבון ביחס של 1:6 (v/v, מדגם: חוצץ) ומערבולות לזמן קצר.הערה: בשלב זה יש ליצור חלקיקי חלבון קולואידיים, והתמיסה תיראה שקופה אם כמות החלבון מספקת. פתח את מכסה עמוד המיקרו ספין של לכידת המתלים והרכיב את עמוד הספין על צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ”ל כדי לאסוף זרימה. הוסף עד 200 μL של תערובת חלבון ליזט חומצי לתוך העמודה. צנטריפוגה את העמוד ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות. חלקיקי חלבון נלכדו; חזור על הפעולה עד לטעינת הדגימות לעמודה. הוסף 150 μL של חיץ קשירת חלבון וצנטריפוגה ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות כדי לשטוף את החלבון מרחף. חזור על הפעולה 3x. הרכיבו את עמוד המיקרו לכידת המתלים על צינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ”ל. הוסף 20 μL של 50mM מאגר עיכול TEAB המכיל פרוטאז ביחס של 1:25 (w/w, טריפסין: חלבון) למסנן בתוך עמוד הסחרור, ובכך הימנע מבועות ומרווח אוויר בין המסנן לתמיסת העיכול. כבשו את עמוד המיקרו-ספין של לכידת המתלים כדי למנוע אידוי. לדגור ב 47 ° C במשך 1 שעה ב thermomixer; אין לרעוד או לערבל במהלך העיכול. פפטידים Elute עם 40 μL של 50 mM TEAB על ידי כוח צנטריפוגלי ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות. הוסף 40 μL של 0.2% FA וצנטריפוגה ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות. הוסף 35 μL של 0.2% FA, 50% acetonitrile, וצנטריפוגה ב 4,000 × גרם במשך 20 שניות. בריכה שלוש פולטת ומיובשת עם צנטריפוגת ואקום. יש לאחסן במקפיא בטמפרטורה אולטרה-נמוכה של -80°C עד לניתוח נוסף. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. 5. שחזור פפטידים לניתוח ספקטרומטריית מסות הרכיבו מחדש את הדגימה עם 12 μL של 0.1% FA, מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר. מדוד ריכוז פפטיד באמצעות ערכת בדיקת פפטידים. נרמל את ריכוז הפפטיד ל-0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר ב-0.1% FA. מעבירים את תערובת הפפטיד לבקבוקון אוטודוגר ומוכנים לניתוח ספקטרומטריית מסות. 6. רכישת דגימה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם טען 3 מיקרוגרם של הפפטיד עם מאגר העמסה איזוקרטית (0.1% FA, 5% ACN) לעמוד מלכודת (C18, 5 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 20 מ”מ) בקצב זרימה של 2 מיקרוליטר/דקה למשך 15 דקות. שבר את הפפטידים באמצעות טור ננו-אנליטי הפוך (C18, 5 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 300 מ”מ) בקצב זרימה של 350 nL/min בשיפוע הפרדה של 155 דקות. השתמש בפאזה A ניידת הכוללת תערובת של 0.1% חומצה פורמית (v/v), 5% ACN (v/v) במים ושלב B נייד המכיל 0.1% FA (v/v), 98% ACN (v/v) במים. השתמש במעבר הצבע הבא: 0-0.5 דקות: 5% B, 0.5-90 דקות: 10% B, 90-120 דקות: 20% B, 120-130 דקות: 28% B, 130-135 דקות: 45% B, 135-141 דקות: 80% B, 141-155 דקות: 5% B. בצע רכישה תלוית נתונים (DDA) עם טווח סריקת TOF-MS בין 350 ל- 1800 m/z עם זמן הצטברות של 250 ms וזמן אי-הכללת יעד דינמי של 18 שניות. לאחר מכן, בצע סריקת MS/MS במהירות של 100 עד 1,800 m/z במצב רגישות גבוהה עם זמן הצטברות של 50 ms עבור 50 המבשרים המובילים בכל מחזור עם סף של 125 cps עבור אות MS/MS עם מצב טעינה מ- +2 עד +4. נתח נתונים גולמיים באמצעות התוכנה שבוצעה אליה הפניה או מנועים תואמים אחרים עם מסד נתונים סימוכין ב- FASTA ממסד הנתונים UniProt הנגיש לציבור.