Подготовка образца для улавливания белковой суспензии для слезной протеомики методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии

Испытуемые предоставляли письменное информированное согласие перед участием в исследовании. Исследование было одобрено Комитетом по этике человека Гонконгского политехнического университета и соответствовало принципам Хельсинкской декларации. 1. Сбор слезной жидкости человека с помощью полоски Ширмера Наденьте перчатки и продезинфицируйте, чтобы избежать загрязнения образца. Убедитесь, что внутренняя упаковка не повреждена, стерильна и не просрочена. Слегка согните верхнюю часть полоски Ширмера внутрь на отметке 0 мм, как показано рядом с полукруглым кончиком полоски (Рисунок 1). Извлеките полоску из внутренней упаковки, держась за конец полоски, и избегайте прямого контакта с зоной забора пробы от 0 до 25 мм. Попросите испытуемого отвести взгляд от положения полоски, которую нужно разместить. Аккуратно опустите нижнее веко и зацепите конец полоски в нижнем своде возле латеральной области кантуса (рис. 2). Повторите ту же процедуру на другом глазу. Попросите испытуемого осторожно закрыть веки, чтобы свести к минимуму раздражение. Собирайте слезную жидкость в течение примерно 5 минут, а лучше 15-20 мм образца слезы. Попросите испытуемого открыть оба глаза, осторожно опустите нижнее веко и снимите полоски с объекта. Проверьте гидратированную длину на полоске Ширмера и запишите собранное количество в мм. Высушите полосу стандартным чистым нагревателем рамы до полного высыхания жидкости.ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать чрезмерного нагрева, который потенциально может обуглить фильтровальную бумагу. Поместите каждую высушенную полоску Ширмера в маркированную криопробирку и храните ее предпочтительно в прохладном, сухом месте в темноте до дальнейшей обработки. 2. Приготовление химикатов и реагентов Лизисный буфер (5% SDS, 50 мМ TEAB, pH 7,5), 20 млПипетка 1 мл 1 М TEAB и 80 мкл 12% ортофосфорной кислоты. Вихрь и кратковременная ультразвуковая обработка для удаления пузырьков. Долейте до 20 мл деионизированной воды. Отвешивают 1 г СДС и добавляют в раствор с колебаниями до полного растворения. Буфер для осаждения белка (90% метанола, 100 мМ TEAB, pH 7,1), 10 млДобавьте 893 мкл 1 М TEAB и 92 мкл деионизированной воды. Добавьте в раствор 15 мкл 85 мас.% фосфорной кислоты и 9 мл метанола и кратковременно перемешайте. Буфер для пищеварения (50 мМ TEAB), 1 млДобавьте 50 мкл 1 M TEAB и долейте до 1 мл деионизированной воды. 200 мМ раствор дитиотрейтола (DTT), 500 мклВзвесьте 15 мг ДТТ и растворите в 500 мкл деионизированной воды; вихрь кратко.ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте перед использованием. Раствор йодоацетамида (IAA) 400 мМ, 200 мклВзвесьте 15 мг IAA и растворите в 200 мкл деионизированной воды; вихрь кратко. ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьтесь перед использованием и избегайте света. 0,2% муравьиная кислота, 50% ацетонитрил, 10 млПриготовьте 10 мл 50% ацетонитрила в деионизированной воде. Добавьте 20 мкл муравьиной кислоты и быстро перемешайте. 0,2% раствор муравьиной кислоты, 10 млДобавьте 20 мкл муравьиной кислоты в 10 мл деионизированной воды и ненадолго взбейте в перемешательном режиме. 0,1% раствор муравьиной кислоты, 10 млДобавьте 10 мкл муравьиной кислоты к 10 мл деионизированной воды; вихрь кратко. 3. Экстракция белка в полосе Ширмера Отрежьте и выбросьте передний конец за отметкой 0 мм полосы, чтобы удалить возможное загрязнение из-за контакта тканей конъюнктивы с чистыми ножницами из нержавеющей стали. Разрежьте полоску с интервалом 1 мм на пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл (Рисунок 3). Добавьте 100 мкл лизисного буфера в микроцентрифужную пробирку и встряхните при 1000 об/мин при комнатной температуре в течение 1 ч в термомиксере. Кратковременно центрифугируйте и перелейте надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Переместите полоски в наконечники для пипеток объемом 200 мкл с помощью чистых щипцов. Поместите наконечники в ту же пробирку, что и на шаге 3.4, с держателем и центрифугой при комнатной температуре при 4 000 × г в течение 1 мин для максимального восстановления оставшегося образца на полоске. Измерьте концентрацию белка с помощью бисинхониновой кислоты (BCA) или анализа совместимого белка. 4. Подготовка образцов для улавливания суспензии Нормализовать образцы до 50 мкг белка в зависимости от результата анализа белка. Добавьте 200 мМ ДТТ в соотношении 1:10 (v/v, DTT: образец) до конечной концентрации 20 мМ ДТТ и инкубируйте при 95 °C в течение 10 мин. Остудите белковый раствор до комнатной температуры. Добавляют 400 мМ IAA в соотношении 1:10 (v/v, IAA: образец) до конечной концентрации 40 мМ IAA и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавьте 12% водной фосфорной кислоты в соотношении 1:10 (v/v, кислота: образец) до конечной концентрации 1,2% фосфорной кислоты и кратковременно перемешайте. Добавьте буфер, связывающий белки в соотношении 1:6 (v/v, образец: буфер) и кратковременно встряхивайте.ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе должны образоваться коллоидные частицы белка, и раствор будет казаться полупрозрачным, если количество белка достаточно. Снимите крышку микроцентрифуговой колонки с улавливанием суспензии и соберите ее на микроцентрифужную пробирку объемом 2 мл для сбора потока. Добавьте в колонку до 200 мкл подкисленной смеси лизата белка. Центрифугируют колонку при 4 000 × г в течение 20 с. Белковые частицы были захвачены; Повторяйте до тех пор, пока образцы не будут загружены в столбец. Добавьте 150 мкл буфера, связывающего белок, и центрифугу при 4000 × г в течение 20 с, чтобы промыть взвешенный белок. Повторить 3 раза. Установите микроколонку для улавливания суспензии на новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 20 мкл 50 мМ пищеварительного буфера TEAB, содержащего протеазу, в соотношении 1:25 (w/w, трипсин: белок) на фильтр внутри спиновой колонны, избегая пузырьков и воздушного зазора между фильтром и раствором для сбраживания. Закройте микроспин-колонку с улавливанием суспензии, чтобы предотвратить испарение. Выдерживают при 47 °С в течение 1 ч в термомиксере; Не встряхивайте и не встряхивайте во время пищеварения. Элюируют пептиды с 40 мкл 50 мМ TEAB под действием центробежной силы при 4 000 × г в течение 20 с. Добавьте 40 мкл 0,2% ТЖК и центрифугируйте при 4000 × г в течение 20 с. Добавьте 35 мкл 0,2% ЖК, 50% ацетонитрила и центрифугу при 4000 × г в течение 20 с. Три пула элюаты и сушка с помощью вакуумной центрифуги. Хранить при температуре -80 °C в сверхнизкотемпературной морозильной камере до дальнейшего анализа. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. 5. Восстановление пептидов для масс-спектрометрического анализа Восстановите образец с 12 мкл 0,1% ЖК, вихрями и центрифугой на короткое время. Измерьте концентрацию пептидов с помощью набора для анализа пептидов. Нормализовать концентрацию пептидов до 0,5 мкг/мкл в 0,1% ЖК. Пептидную смесь переложить во флакон с автосамплером и подготовить к масс-спектрометрическому анализу. 6. Отбор образцов методом жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии Загружают 3 мкг пептида с буфером изократической загрузки (0,1% ЖК, 5% АКН) в колонку-ловушку (С18, 5 мкм, 100 мкм, 20 мм) со скоростью потока 2 мкл/мин в течение 15 мин. Фракционирование пептидов с помощью наноаналитической колонки с обращенной фазой (C18, 5 мкм, 100 мкм, 300 мм) со скоростью потока 350 нл/мин при градиенте разделения 155 мин. Используйте подвижную фазу А, содержащую смесь 0,1% муравьиной кислоты (v/v), 5% ACN (v/v) в воде и подвижную фазу B, содержащую 0,1% FA (v/v), 98% ACN (v/v) в воде. Используйте следующий градиент: 0-0,5 мин: 5% В, 0,5-90 мин: 10% В, 90-120 мин: 20% В, 120-130 мин: 28% В, 130-135 мин: 45% В, 135-141 мин: 80% В, 141-155 мин: 5% В. Выполняйте сбор данных (DDA) с диапазоном сканирования TOF-MS от 350 до 1800 м/z с временем накопления 250 мс и временем динамического исключения цели 18 с. Затем проводят сканирование МС/МС на скорости от 100 до 1800 м/з в режиме высокой чувствительности с временем накопления 50 мс для 50 верхних прекурсоров за цикл с порогом 125 сПс для сигнала МС/МС с состоянием заряда от +2 до +4. Анализируйте необработанные данные с помощью справочного программного обеспечения или других совместимых движков с эталонной базой данных в FASTA из общедоступной базы данных UniProt.