Preparación de muestras con captura de suspensión de proteínas para proteómica lagrimal mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem

Los sujetos dieron su consentimiento informado por escrito antes de participar en el estudio. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Humana de la Universidad Politécnica de Hong Kong y se adhirió a los principios de la Declaración de Helsinki. 1. Recolección de líquido lagrimal humano con tira de Schirmer Use guantes y desinfecte para evitar la contaminación de la muestra. Compruebe que el embalaje interior esté intacto, estéril y no caducado. Doble la parte superior de la tira Schirmer ligeramente hacia adentro en la marca de 0 mm, como se indica cerca de la punta semicircular de la tira (Figura 1). Retire la tira del paquete interior sujetando el extremo de la tira y evite el contacto directo con el área de recolección de muestras de 0 a 25 mm. Pídale al sujeto que desvíe la mirada de la posición de la tira que se va a colocar. Tire suavemente hacia abajo del párpado inferior y enganche el extremo de la tira en el fórnix inferior cerca de la región lateral del canto (Figura 2). Repita el mismo procedimiento en el otro ojo. Pídale al sujeto que cierre suavemente los párpados para minimizar la irritación. Recoja el líquido lagrimal durante unos 5 minutos o, preferiblemente, se recolectó una muestra lagrimal de 15-20 mm. Pídale al sujeto que abra ambos ojos, tire suavemente hacia abajo del párpado inferior y retire las tiras del sujeto. Inspeccione la longitud hidratada en la tira Schirmer y registre la cantidad recolectada en mm. Seque la tira con un calentador de marco limpio estándar hasta que el líquido esté completamente seco.NOTA: Se debe evitar el calentamiento excesivo que podría carbonizar el papel de filtro. Inserte cada tira seca de Schirmer en un criotubo etiquetado y guárdela preferiblemente en un lugar fresco y seco en la oscuridad hasta su posterior procesamiento. 2. Preparación de productos químicos y reactivos Tampón de lisis (SDS al 5 %, 50 mM TEAB, pH 7,5), 20 mlPipeta 1 mL de TEAB 1 M y 80 μL de ácido fosfórico al 12%. Vórtice y sonique brevemente para eliminar las burbujas. Rellene hasta 20 ml con agua desionizada. Pesar 1 g de SDS y añadir a la solución con oscilación hasta que se disuelva. Tampón de precipitación de proteínas (metanol al 90 %, 100 mM de TEAB, pH 7,1), 10 mlAñadir 893 μL de 1 M de TEAB y 92 μL de agua desionizada. Añadir 15 μL de ácido fosfórico al 85 % en peso y 9 mL de metanol a la solución y al vórtice brevemente. Tampón de digestión (50 mM TEAB), 1 mLAñadir 50 μL de TEAB 1 M y rellenar hasta 1 mL con agua desionizada. 200 mM de solución de ditiotreitol (DTT), 500 μLPesar 15 mg de DTT y disolver en 500 μL de agua desionizada; vórtice brevemente.NOTA: Preparar antes de usar. 400 mM de solución de yodoacetamida (IAA), 200 μLPesar 15 mg de IAA y disolver en 200 μL de agua desionizada; vórtice brevemente. NOTA: Preparar antes de usar y evitar la luz. 0,2 % ácido fórmico, 50 % acetonitrilo, 10 mlPreparar 10 mL de acetonitrilo al 50% en agua desionizada. Añadir 20 μL de ácido fórmico y vórtice brevemente. Solución de ácido fórmico al 0,2 %, 10 mlAñadir 20 μL de ácido fórmico a 10 mL de agua desionizada y vórtice brevemente. Solución de ácido fórmico al 0,1 %, 10 mlAñadir 10 μL de ácido fórmico a 10 mL de agua desionizada; vórtice brevemente. 3. Extracción de proteínas en tira de Schirmer Corte y deseche la parte delantera más allá de la marca de 0 mm de la tira para eliminar la posible contaminación debido al contacto de los tejidos conjuntivales con unas tijeras limpias de acero inoxidable. Corte la tira en intervalos de 1 mm en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (Figura 3). Añadir 100 μL de tampón de lisis al tubo de microcentrífuga y vórtice a 1.000 rpm, temperatura ambiente durante 1 h en una termomezcladora. Centrifugar brevemente y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mueva las tiras a puntas de pipeta de 200 μL con unas pinzas limpias. Coloque las puntas en el mismo tubo del paso 3.4 con soporte y centrífuga a temperatura ambiente a 4.000 × g durante 1 minuto más para obtener la máxima recuperación de la muestra restante en la tira. Mida la concentración de proteínas mediante ácido bicincónico (BCA) o un ensayo de proteínas compatibles. 4. Preparación de muestras con atrapamiento de suspensión Normalice las muestras a 50 μg de proteína en función del resultado del ensayo de proteína. Añadir 200 mM de TDT en una proporción de 1:10 (v/v, TDT: muestra) a una concentración final de 20 mM de TDT e incubar a 95 °C durante 10 min. Enfríe la solución proteica a temperatura ambiente. Añadir 400 mM de IAA en una proporción de 1:10 (v/v, IAA: muestra) hasta una concentración final de 40 mM de IAA e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 min. Añadir un 12% de ácido fosfórico acuoso en una proporción de 1:10 (v/v, ácido: muestra) hasta una concentración final de ácido fosfórico al 1,2% y vórtice brevemente. Agregue tampón de unión a proteínas en una proporción de 1:6 (v/v, muestra: tampón) y vórtice brevemente.NOTA: En este paso, se deben formar partículas de proteína coloidal y la solución aparecerá translúcida si la cantidad de proteína es suficiente. Destape la columna de microcentrifugación de captura de suspensión y ensamble la columna de centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 2 ml para recolectar el flujo. Añadir hasta 200 μL de mezcla de lisado de proteínas acidificadas en la columna. Centrifugar la columna a 4.000 × g durante 20 s. Las partículas proteicas quedaron atrapadas; Repita hasta que las muestras se carguen en la columna. Añadir 150 μL de tampón fijador de proteínas y centrifugar a 4.000 × g durante 20 s para lavar la proteína en suspensión. Repita 3 veces. Ensamble la microcolumna de captura de suspensión en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Añadir 20 μL de tampón de digestión TEAB de 50 mM que contenga proteasa en una proporción de 1:25 (p/p, tripsina: proteína) en el filtro dentro de la columna de centrifugación, evitando burbujas y espacio de aire entre el filtro y la solución de digestión. Tape la columna de microgiro de atrapamiento de suspensión para evitar la evaporación. Incubar a 47 °C durante 1 h en una termobatidora; No agite ni haga vórtices durante la digestión. Eluir péptidos con 40 μL de TEAB de 50 mM por fuerza centrífuga a 4.000 × g durante 20 s. Añadir 40 μL de AG al 0,2% y centrifugar a 4.000 × g durante 20 s. Añadir 35 μL de AG al 0,2%, acetonitrilo al 50% y centrifugar a 4.000 × g durante 20 s. Piscina tres eluidos y secado con una centrífuga al vacío. Almacenar a -80 °C en el congelador a temperatura ultrabaja hasta su posterior análisis. NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. 5. Reconstituir péptidos para análisis de espectrometría de masas Reconstituya la muestra con 12 μL de AG al 0,1%, vórtice y centrifugar brevemente. Mida la concentración de péptidos con un kit de ensayo de péptidos. Normalizar la concentración de péptidos a 0,5 μg/μL en AG al 0,1%. Transfiera la mezcla de péptidos a un vial de muestreador automático y esté lista para el análisis de espectrometría de masas. 6. Adquisición de muestras por cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem Cargue 3 μg del péptido con tampón de carga isocrática (0,1 % de AG, 5 % de ACN) en una columna trampa (C18, 5 μm, 100 μm, 20 mm) a un caudal de 2 μL/min durante 15 min. Fraccionar los péptidos utilizando una nanocolumna analítica de fase reversa (C18, 5 μm, 100 μm, 300 mm) a un caudal de 350 nL/min en un gradiente de separación de 155 min. Utilice la fase móvil A que comprende una mezcla de 0,1% de ácido fórmico (v/v), 5% de ACN (v/v) en agua y la fase móvil B que contiene 0,1% de FA (v/v), 98% de ACN (v/v) en agua. Utilice el siguiente gradiente: 0-0,5 min: 5% B, 0,5-90 min: 10% B, 90-120 min: 20% B, 120-130 min: 28% B, 130-135 min: 45% B, 135-141 min: 80% B, 141-155 min: 5% B. Realice la adquisición dependiente de datos (DDA) con un rango de escaneo TOF-MS entre 350 y 1800 m/z con un tiempo de acumulación de 250 ms y un tiempo de exclusión de objetivos dinámicos de 18 s. A continuación, realice un escaneo MS/MS a 100 a 1.800 m/z en modo de alta sensibilidad con un tiempo de acumulación de 50 ms para los 50 precursores principales por ciclo con un umbral de 125 cps para la señal MS/MS con un estado de carga de +2 a +4. Analice los datos sin procesar con el software referenciado u otros motores compatibles con una base de datos de referencia en FASTA de la base de datos UniProt de acceso público.