Di (2-etilheksil) Ftalatın Metabolit Üretimi Üzerindeki Etkisini İncelemek için Yonca Kökü Eksüdalarının Toplanması
Summary
Kök eksüdalarının salgılanması genellikle stres koşulları altındaki bitkiler için harici bir detoksifikasyon stratejisidir. Bu protokol, ksenobiyotiklerin yonca üzerindeki etkisinin hedefsiz metabolomik analiz yoluyla nasıl değerlendirileceğini açıklar.
Abstract
Kök eksüdaları, bitki kökleri ile çevre arasındaki bilgi iletişimi ve enerji transferinin ana ortamıdır. Kök eksüdalarının salgılanmasındaki değişiklik genellikle stres koşulları altındaki bitkiler için harici bir detoksifikasyon stratejisidir. Bu protokol, di (2-etilheksil) ftalatın (DEHP) metabolit üretimi üzerindeki etkisini incelemek için yonca kökü eksüdalarının toplanması için genel kılavuzlar getirmeyi amaçlamaktadır. İlk olarak, yonca fideleri topraksız bir kültür deneyinde DEHP stresi altında yetiştirilir. İkincisi, bitkiler kök eksüdalarını toplamak için 6 saat boyunca 50 mL sterilize ultra saf su içeren santrifüj tüplerine aktarılır. Çözeltiler daha sonra vakumlu dondurarak kurutucuda dondurularak kurutulur. Dondurulmuş numuneler bis(trimetilsilil)) trifloroasetamid (BSTFA) reaktifi ile ekstrakte edilir ve türetilir. Daha sonra, türetilmiş ekstraktlar, uçuş zamanı kütle spektrometresi (GC-TOF-MS) ile birleştirilmiş bir gaz kromatograf sistemi kullanılarak ölçülür. Elde edilen metabolit verileri daha sonra biyoinformatik yöntemlere dayanarak analiz edilir. Diferansiyel metabolitler ve önemli ölçüde değişmiş metabolizma yolakları, kök eksüdaları açısından DEHP’nin yonca üzerindeki etkisini ortaya çıkarmak için derinlemesine araştırılmalıdır.
Introduction
Di (2-etilheksil) ftalat (DEHP), plastisitelerini ve mukavemetlerini arttırmak için çeşitli plastik ve polimerlerde plastikleştirici olarak yaygın olarak kullanılan sentetik bir kimyasal bileşiktir. Son birkaç yılda, giderek artan sayıda çalışma, DEHP’nin bir endokrin bozucu olduğunu ve insanların ve diğer hayvanların solunum, sinir ve üreme sistemleri üzerinde olumsuz etkisi olduğunu ileri sürmüştür 1,2,3. Sağlık riski göz önüne alındığında, Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı, Avrupa Birliği ve Çin Çevre İzleme Merkezi, DEHP’yi öncelikli kirleticiler listesinde sınıflandırmıştır. Toprak, plastik malçlama ve organik gübrelerin uygulanması, atık su ile sulama ve çamur çiftliği uygulaması nedeniyle DEHP’nin çevrede önemli bir lavabosu olarak kabul edilmiştir4. Beklendiği gibi, DEHP, içeriği Çin’deki bazı bölgelerde kilogram kuru toprak başına miligrama kadar ulaşan tarım arazisi topraklarında her yerde tespit edilmiştir 5,6. DEHP, bitkilere esas olarak kökler yoluyla girebilir ve toprak ekosistemlerinde farklı trofik seviyelerde biyomagnifikasyona uğrayabilir7. Bu nedenle, son yıllarda bitkilerde DEHP’nin neden olduğu stres hakkında önemli endişeler ortaya çıkmıştır.
Bitkiler genellikle DEHP maruziyetine karşı savunmasızdır. DEHP stresinin tohum çimlenmesi ve normal metabolizma üzerinde olumsuz bir etki yarattığı ve böylece bitki büyümesini ve gelişimini engellediği gözlenmiştir 8,9. Örneğin, DEHP mezofil hücrelerine oksidatif hasara neden olabilir, klorofil ve ozmolit içeriğini azaltabilir ve antioksidatif enzim aktivitelerini yükseltebilir, sonuçta yenilebilir bitkilerin veriminde ve kalitesinde bir düşüşe neden olabilir10,11. Bununla birlikte, bitkilerin DEHP stresine tepkisi üzerine yapılan önceki çalışmaların çoğu, oksidatif strese ve fizyolojik ve biyokimyasal özelliklere odaklanmıştır. Bitki metabolizması ile ilişkili karşılık gelen mekanizmalar daha az çalışılmıştır. Kök eksüdaları, bitki köklerinin salgıladığı ve çevreye saldığı bileşikleri tanımlayan genel bir terimdir. Bitkiler ve rizosfer toprağı arasındaki etkileşim ortamı olarak kabul edilmişlerdir ve bitki büyümesini ve gelişimini desteklemede önemli bir rol oynamaktadırlar12. Kök eksüdalarının tüm fotosentetik karbon13’ün yaklaşık% 30-40’ını oluşturduğu iyi bilinmektedir. Kirlenmiş ortamlarda, kök eksüdaları, bitkilerin metabolizma veya dış dışlama yoluyla kirleticilerin stresine karşı toleransını arttırmada rol oynar14. Sonuç olarak, bitki kökü eksüdalarının kirlilik stresine tepkisinin derinlemesine anlaşılması, hücre biyokimyası ve biyolojik fenomenlerle ilişkili temel mekanizmaların ortaya çıkarılmasına yardımcı olabilir15.
Metabolomik teknoloji, hücreler 16,17, dokular18 ve hatta şekerler, organik asitler, amino asitler ve lipitler dahil olmak üzere organizmalarıneksüdaları 19 içinde aynı anda çok sayıda küçük molekül metabolitini ölçmek için etkili bir strateji sağlar. Geleneksel veya klasik kimyasal analiz yöntemleriyle karşılaştırıldığında, metabolomik yaklaşım, tespit edilebilen metabolit sayısını büyük ölçüde artırır20, bu da metabolitleri daha yüksek verimli bir şekilde tanımlamaya ve anahtar metabolik yolları tanımlamaya yardımcı olabilir. Metabolomik, ağır metaller21, ortaya çıkan kirleticiler22 ve nanopartiküller19 gibi stres ortamlarında biyolojik tepkinin araştırma alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bitkiler üzerinde yapılan bu çalışmaların çoğu, iç bitki dokularındaki metabolik değişikliklere odaklanırken, kök eksüdalarının çevresel strese tepkisi hakkında çok az şey bildirilmiştir. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, DEHP’nin metabolit üretimi üzerindeki etkisini incelemek için yonca kökü eksüdalarının toplanması için genel kılavuzları tanıtmaktır. Sonuçlar, DEHP tarafından bitki metabolomiklerinin takip çalışması için bir yöntem rehberliği sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, DEHP stresi altında yonca kök eksüdalarının nasıl toplanacağı ve ölçüleceği ve metabolom verilerinin nasıl analiz edileceği konusunda genel rehberlik sağlar. Bu protokoldeki bazı kritik adımlara çok dikkat edilmesi gerekiyor. Hidroponik kültür deneylerinde, yonca fideleri, farklı konsantrasyonlarda DEHP’ye sahip besin çözeltileri ile doldurulmuş cam şişelerde hidroponik olarak kültürlenmiştir. Cam şişeler, DEHP’nin fotolizini önlemek ve tüm kültür çözeltilerinde DEHP kons…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (41877139), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (41991335) Büyük Projeleri, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFD0800204), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. BK20161616), “135” Planı ve Çin Bilimler Akademisi Sınır Programı (ISSASIP1615).
Materials
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
References
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
- van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
- Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
- Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
- Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
- Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
- Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
- Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
- Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
- Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
- Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
- Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
- vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
- Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
- Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
- Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
- Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
- Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
- Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
- Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
- Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
- Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
- van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
- Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , 319-321 (2003).
- Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
- Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
- Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
- Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
- Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).
