Сбор экссудатов корня люцерны для изучения влияния ди(2-этилгексил)фталата на продукцию метаболитов
Summary
Секреция корневых экссудатов обычно является внешней стратегией детоксикации растений в стрессовых условиях. В этом протоколе описывается, как оценить влияние ксенобиотиков на люцерну с помощью нецелевого метаболомного анализа.
Abstract
Корневые экссудаты являются основным средством передачи информации и передачи энергии между корнями растений и окружающей средой. Изменение секреции корневых экссудатов обычно является внешней стратегией детоксикации растений в условиях стресса. Этот протокол направлен на введение общих рекомендаций по сбору экссудатов корня люцерны для изучения влияния ди(2-этилгексил)фталата (DEHP) на производство метаболитов. Во-первых, саженцы люцерны выращивают под давлением DEHP в эксперименте по гидропонной культуре. Во-вторых, растения переносят в центрифужные пробирки, содержащие 50 мл стерилизованной сверхчистой воды, в течение 6 часов для сбора корневых экссудатов. Затем растворы лиофилизируют в вакуумной сублимационной сушилке. Замороженные образцы экстрагируют и дериватизируют реагентом бис(триметилсилил)) трифторацетамида (БСТФА). Затем дериватизированные экстракты измеряют с помощью системы газового хроматографа в сочетании с времяпролетным масс-спектрометром (ГХ-ТОФ-МС). Полученные данные о метаболитах затем анализируются на основе биоинформатических методов. Дифференциальные метаболиты и значительно измененные пути метаболизма должны быть глубоко изучены, чтобы выявить влияние DEHP на люцерну с учетом корневых экссудатов.
Introduction
Ди(2-этилгексил)фталат (DEHP) представляет собой синтетическое химическое соединение, которое широко используется в различных пластмассах и полимерах в качестве пластификатора для повышения их пластичности и прочности. В последние несколько лет все большее число исследований показало, что DEHP является эндокринным разрушителем и оказывает неблагоприятное воздействие на дыхательную, нервную и репродуктивную системы человека и других животных 1,2,3. Учитывая риск для здоровья, Агентство по охране окружающей среды США, Европейский Союз и Центр мониторинга окружающей среды Китая включили DEHP в список приоритетных загрязнителей. Почва считается важным поглотителем DEHP в окружающую среду из-за применения пластикового мульчирования и органических удобрений, орошения сточными водами и применения на иловых фермах4. Как и ожидалось, в почвах сельскохозяйственных угодий повсеместно обнаружен DEHP, содержание которого в некоторыхрегионах Китая достигает даже 5,6 миллиграмма на килограмм высохшей почвы. DEHP может проникать в растения главным образом через корни и подвергаться биоусилению на различных трофических уровнях в почвенных экосистемах7. Поэтому в последние десятилетия была высказана серьезная озабоченность по поводу стресса, вызванного DEHP в растениях.
Растения обычно уязвимы к воздействию DEHP. Было замечено, что стресс DEHP оказывает неблагоприятное воздействие на прорастание семян и нормальный обмен веществ, тем самым подавляя рост и развитие растений 8,9. Например, DEHP может вызывать окислительное повреждение клеток мезофилла, уменьшать содержание хлорофилла и осмолитов и повышать активность антиоксидантных ферментов, что в конечном итоге приводит к снижению урожайности и качества съедобных растений10,11. Однако большинство предыдущих исследований реакции растений на стресс DEHP были сосредоточены на окислительном стрессе и физиологических и биохимических характеристиках. Соответствующие механизмы, связанные с метаболизмом растений, менее изучены. Корневые экссудаты — это общий термин, описывающий соединения, которые корни растений выделяют и выделяют в окружающую среду. Они рассматривались как среда взаимодействия между растениями и ризосферной почвой, играющая важную роль в поддержке роста и развития растений12. Хорошо известно, что корневые экссудаты составляют примерно 30-40% всего фотосинтезирующегоуглерода 13. В загрязненной среде корневые экссудаты участвуют в повышении устойчивости растений к стрессу загрязняющих веществ посредством метаболизма или внешнего исключения14. Как следствие, глубокое понимание реакции экссудатов корней растений на стресс загрязнения может помочь выявить основные механизмы, связанные с биохимией клеток и биологическими явлениями15.
Технология метаболомики обеспечивает эффективную стратегию одновременного измерения большого количества низкомолекулярных метаболитов в клетках 16,17, тканях18 и даже экссудатах организмов 19, включая сахара, органические кислоты, аминокислоты и липиды. По сравнению с традиционными или классическими методами химического анализа, метаболомный подход значительно увеличивает количество метаболитов, которые могут быть обнаружены20, что может помочь идентифицировать метаболиты с большей пропускной способностью и определить ключевые метаболические пути. Метаболомика широко используется в области исследований биологической реакции в стрессовых средах, таких как тяжелые металлы21, новые загрязнители22 и наночастицы19. Большинство из этих исследований на растениях были сосредоточены на метаболических изменениях во внутренних тканях растений, в то время как лишь немногие из них были зарегистрированы о реакции корневых экссудатов на стресс окружающей среды. Таким образом, целью данного исследования является введение общих рекомендаций по сбору экссудатов корня люцерны для изучения влияния DEHP на продукцию метаболитов. Результаты послужат методическим руководством для последующего изучения метаболомики растений с помощью DEHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол содержит общие рекомендации по сбору и измерению корневых экссудатов люцерны при стрессе DEHP, а также по анализу данных метаболома. Пристальное внимание необходимо уделить некоторым критическим шагам в этом протоколе. В экспериментах по гидропонным культурам саженцы люц…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана совместно Национальным фондом естественных наук Китая (41877139), Крупными проектами Национального фонда естественных наук Китая (41991335), Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2016YFD0800204), Фондом естественных наук провинции Цзянсу (No BK20161616), Планом «135» и Программой границ Китайской академии наук (ISSASIP1615).
Materials
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
References
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
- van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
- Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
- Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
- Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
- Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
- Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
- Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
- Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
- Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
- Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
- Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
- vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
- Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
- Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
- Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
- Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
- Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
- Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
- Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
- Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
- Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
- van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
- Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , 319-321 (2003).
- Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
- Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
- Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
- Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
- Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).
