הפרשת ההפרשה של שורשים היא בדרך כלל אסטרטגיית ניקוי רעלים חיצונית לצמחים בתנאי עקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את ההשפעה של קסנוביוטיקה על אספסת באמצעות ניתוח מטבולי לא ממוקד.
הפרשות שורשים הן המדיה העיקרית של תקשורת מידע והעברת אנרגיה בין שורשי הצמח לסביבה. השינוי בהפרשת ההפרשה של שורשים הוא בדרך כלל אסטרטגיית ניקוי רעלים חיצונית לצמחים בתנאי עקה. פרוטוקול זה נועד להציג הנחיות כלליות לאיסוף הפרשות שורש אספסת כדי לחקור את ההשפעה של di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) על ייצור מטבוליטים. ראשית, שתילי אספסת גדלים תחת לחץ DEHP בניסוי תרבית הידרופונית. שנית, הצמחים מועברים לצינורות צנטריפוגות המכילים 50 מ”ל מים אולטרה-טהורים מעוקרים למשך 6 שעות כדי לאסוף הפרשות שורשים. לאחר מכן התמיסות מיובשות בהקפאה במייבש בהקפאה בוואקום. הדגימות הקפואות מופקות ומפורקות באמצעות מגיב bis(trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA). לאחר מכן, התמציות המפורקות נמדדות באמצעות מערכת כרומטוגרף גז יחד עם ספקטרומטר מסה בזמן טיסה (GC-TOF-MS). נתוני המטבוליטים שנרכשו מנותחים לאחר מכן על בסיס שיטות ביואינפורמטיקה. מטבוליטים דיפרנציאליים ומסלולי חילוף חומרים שהשתנו באופן משמעותי צריכים להיחקר לעומק כדי לחשוף את ההשפעה של DEHP על אספסת לאור הפרשות שורש.
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) הוא תרכובת כימית סינתטית הנמצאת בשימוש נרחב פלסטיק ופולימרים שונים כמו plasticizer כדי לשפר את הפלסטיות שלהם ואת החוזק. בשנים האחרונות, מספר גדל והולך של מחקרים הציעו כי DEHP הוא משבש אנדוקריני ויש לו השפעה שלילית על מערכות הנשימה, העצבים והרבייה של בני אדם ובעלי חיים אחרים 1,2,3. בהתחשב בסיכון הבריאותי שלה, הסוכנות להגנת הסביבה של ארצות הברית, האיחוד האירופי ומרכז ניטור הסביבה של סין סיווגו כולם DEHP ברשימת המזהמים העדיפים. הקרקע נחשבת לכיור חשוב של DEHP בסביבה, בשל יישום חיפוי פלסטיק ודשנים אורגניים, השקיה במי קולחין ויישום חוות בוצה4. כצפוי, DEHP זוהה בכל מקום בקרקעות חקלאיות, שתכולתן מגיעה אפילו עד מיליגרם לקילוגרם של אדמה יבשה באזורים מסוימים בסין 5,6. DEHP יכול להיכנס לצמחים בעיקר דרך השורשים ולעבור הגדלה ביולוגית ברמות טרופיות שונות במערכות אקולוגיות בקרקע7. לכן, הועלה חשש משמעותי לגבי עקה הנגרמת על ידי DEHP בצמחים במהלך העשורים האחרונים.
צמחים בדרך כלל פגיעים לחשיפה ל- DEHP. לחץ DEHP נצפה כגורם להשפעה שלילית על נביטת זרעים ומטבוליזם תקין, ובכך מעכב צמיחה והתפתחות של צמחים 8,9. לדוגמה, DEHP יכול לגרום נזק חמצוני לתאי מזופיל, להפחית את תכולת הכלורופיל והאוסמוליטים, ולהגביר את פעילות האנזימים נוגדי החמצון, מה שבסופו של דבר גורם לירידה ביבול ובאיכות של צמחי מאכל10,11. עם זאת, רוב המחקרים הקודמים על תגובת צמחים לעקה DEHP התמקדו בעקה חמצונית ובמאפיינים פיזיולוגיים וביוכימיים. המנגנונים המתאימים הקשורים למטבוליזם של צמחים נחקרים פחות. הפרשת שורשים היא מונח גנרי המתאר תרכובות ששורשי הצמח מפרישים ומשחררים לסביבה. הם נחשבו כאמצעי האינטראקציה בין צמחים לאדמת ריזוספרה, וממלאים תפקיד חשוב בתמיכה בצמיחה ובהתפתחות של צמחים12. ידוע כי הפרשות שורשים מהוות כ-30%-40% מכלל הפחמן הפוטוסינתטי13. בסביבות מזוהמות, הפרשות שורשים מעורבות בשיפור הסבילות של צמחים לעקה של מזהמים באמצעות חילוף חומרים או הרחקה חיצונית14. כתוצאה מכך, הבנה מעמיקה של תגובת שורשי הצמח להעקה של זיהום עשויה לסייע בחשיפת המנגנונים הבסיסיים הקשורים לביוכימיה של התא ולתופעות ביולוגיות15.
טכנולוגיית מטבולומיקה מספקת אסטרטגיה יעילה למדידת מספר רב של מטבוליטים של מולקולות קטנות בו זמנית בתוך תאים 16,17, רקמות18, ואפילו הפרשה של אורגניזמים 19, כולל סוכרים, חומצות אורגניות, חומצות אמינו ושומנים. בהשוואה לשיטות ניתוח כימיות מסורתיות או קלאסיות, גישת המטבולומיקה מגדילה מאוד את מספר המטבוליטים שניתן לזהות20, מה שיכול לסייע בזיהוי מטבוליטים בדרך תפוקה גבוהה יותר ובזיהוי מסלולים מטבוליים מרכזיים. מטבולומיקה נמצאת בשימוש נרחב בתחום המחקר של תגובה ביולוגית בסביבות עקה, כגון מתכות כבדות21, מזהמים מתפתחים22 וננו-חלקיקים19. רוב המחקרים הללו על צמחים התמקדו בשינויים המטבוליים ברקמות הפנים של הצמח, בעוד שמעטים דווחו על התגובה של הפרשת שורשים לעקה סביבתית. לכן, מטרת מחקר זה היא להציג הנחיות כלליות לאיסוף הפרשות שורש אספסת כדי לחקור את ההשפעה של DEHP על ייצור מטבוליטים. התוצאות יספקו הנחיית שיטה למחקר המשך של מטבולומיקה של צמחים על ידי DEHP.
פרוטוקול זה מספק הדרכה כללית כיצד לאסוף ולמדוד את הפרשות השורש של אספסת תחת לחץ DEHP, כמו גם כיצד לנתח את נתוני חילוף החומרים. יש להקדיש תשומת לב רבה לכמה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. בניסויים בתרבית הידרופונית, שתילי אספסת תורבתו הידרופונית בבקבוקי זכוכית מלאים בתמיסות מזון עם ריכוזים שונים…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה במשותף על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41877139), הפרויקטים העיקריים של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (41991335), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2016YFD0800204), הקרן למדעי הטבע של מחוז ג’יאנגסו (מס ‘BK20161616), תוכנית “135” ותוכנית הגבולות של האקדמיה הסינית למדעים (ISSASIP1615).
Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
Pyridine | Adamas | HPLC | |
R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |