Coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudo do impacto do ftalato de di(2-etilhexil) na produção de metabólitos
Summary
A secreção de exsudatos radiculares é geralmente uma estratégia de desintoxicação externa para plantas sob condições de estresse. Este protocolo descreve como avaliar o impacto de xenobióticos na alfafa através de análise metabolômica não direcionada.
Abstract
Os exsudatos radiculares são os principais meios de comunicação de informação e transferência de energia entre as raízes das plantas e o ambiente circundante. A alteração na secreção de exsudatos radiculares é geralmente uma estratégia de desintoxicação externa para plantas sob condições de estresse. Este protocolo visa introduzir diretrizes gerais para a coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudar o impacto do ftalato de di(2-etilhexil) (DEHP) na produção de metabólitos. Primeiro, mudas de alfafa são cultivadas sob estresse de DEHP em um experimento de cultivo hidropônico. Em segundo lugar, as plantas são transferidas para tubos de centrífuga contendo 50 mL de água ultrapura esterilizada por 6 h para coletar exsudatos radiculares. As soluções são então liofilizadas em um liofilizador a vácuo. As amostras congeladas são extraídas e derivatizadas com o reagente bis(trimetilsilil)) trifluoroacetamida (BSTFA). Posteriormente, os extratos derivatizados são medidos usando um sistema de cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massas por tempo de voo (GC-TOF-MS). Os dados de metabólitos adquiridos são então analisados com base em métodos de bioinformática. Metabólitos diferenciais e vias metabólicas significativamente alteradas devem ser profundamente explorados para revelar o impacto do DEHP na alfafa em vista dos exsudatos radiculares.
Introduction
O ftalato de di(2-etilhexil) (DEHP) é um composto químico sintético que é amplamente utilizado em vários plásticos e polímeros como plastificante para melhorar sua plasticidade e resistência. Nos últimos anos, um número crescente de estudos tem sugerido que o DEHP é um disruptor endócrino e tem efeito adverso sobre os sistemas respiratório, nervoso e reprodutivo de humanos e outros animais 1,2,3. Considerando seu risco à saúde, a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos, a União Europeia e o Centro de Monitoramento Ambiental da China classificaram o DEHP na lista de poluentes prioritários. O solo tem sido considerado um importante sumidouro de DEHP no meio ambiente, devido à aplicação de cobertura morta plástica e fertilizantes orgânicos, irrigação com água residuária e aplicação de lodo4. Como esperado, o DEHP tem sido detectado de forma ubíqua em solos de terras agrícolas, cujo conteúdo chega a atingir até miligramas por quilograma de solo seco em algumas regiões da China 5,6. O DEHP pode entrar nas plantas principalmente pelas raízes e sofrer biomagnificação em diferentes níveis tróficos nos ecossistemas edáficos7. Portanto, uma preocupação significativa tem sido levantada sobre o estresse induzido pelo DEHP em plantas nas últimas décadas.
As plantas são geralmente vulneráveis à exposição ao DEHP. Observou-se que o estresse DEHP exerce um efeito adverso sobre a germinação e o metabolismo normal das sementes, inibindo o crescimento e desenvolvimento das plantas 8,9. Por exemplo, o DEHP pode induzir danos oxidativos às células do mesofilo, diminuir o conteúdo de clorofila e osmólitos e elevar a atividade enzimática antioxidante, resultando eventualmente em declínio na produtividade e qualidade de plantas comestíveis10,11. No entanto, a maioria dos estudos prévios sobre a resposta das plantas ao estresse por DEHP tem se concentrado no estresse oxidativo e nas características fisiológicas e bioquímicas. Os mecanismos correspondentes associados ao metabolismo vegetal são menos estudados. Exsudato radicular é um termo genérico que descreve compostos que as raízes das plantas secretam e liberam no ambiente. Eles têm sido considerados como o meio de interação entre as plantas e o solo rizosférico, desempenhando um papel importante no suporte ao crescimento e desenvolvimento das plantas12. Sabe-se que os exsudatos radiculares são responsáveis por aproximadamente 30%-40% de todo o carbonofotossintético13. Em ambientes poluídos, exsudatos radiculares estão envolvidos na melhoria da tolerância das plantas ao estresse de poluentes por meio de metabolismo ou exclusão externa14. Como consequência, uma compreensão profunda da resposta dos exsudatos radiculares das plantas ao estresse poluidor pode ajudar a revelar os mecanismos subjacentes associados à bioquímica celular e aos fenômenos biológicos15.
A tecnologia metabolômica fornece uma estratégia eficiente para medir um grande número de metabólitos de pequenas moléculas simultaneamente dentro das células 16,17, tecidos18 e até mesmo exsudatos de organismos 19, incluindo açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos e lipídios. Em comparação com métodos de análise química tradicionais ou clássicos, a abordagem metabolômica aumenta consideravelmente o número de metabólitos que podem ser detectados20, o que pode ajudar a identificar metabólitos de uma maneira de maior rendimento e identificar as principais vias metabólicas. A metabolômica tem sido amplamente utilizada no campo de pesquisa da resposta biológica em ambientes de estresse, como metais pesados21, poluentes emergentes22 e nanopartículas19. A maioria desses estudos em plantas tem se concentrado nas alterações metabólicas nos tecidos interiores das plantas, enquanto poucos têm sido relatados sobre a resposta dos exsudatos radiculares ao estresse ambiental. Portanto, o objetivo deste estudo é apresentar diretrizes gerais para a coleta de exsudatos radiculares de alfafa para estudar o impacto do DEHP na produção de metabólitos. Os resultados fornecerão uma orientação metodológica para o estudo de acompanhamento da metabolômica vegetal pelo DEHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece orientação geral sobre como coletar e medir os exsudatos radiculares da alfafa sob estresse DEHP, bem como analisar os dados do metaboloma. É preciso prestar muita atenção a algumas etapas críticas desse protocolo. Em experimentos de cultivo hidropônico, plântulas de alfafa foram cultivadas hidroponicamente em frascos de vidro preenchidos com soluções nutritivas com diferentes concentrações de DEHP. Os frascos de vidro devem ser protegidos da luz, cobrindo-os com papel alumínio durante…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado conjuntamente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (41877139), os Grandes Projetos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (41991335), o Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Chave da China (2016YFD0800204), a Fundação de Ciências Naturais da Província de Jiangsu (No. BK20161616), o Plano “135” e o Programa de Fronteiras da Academia Chinesa de Ciências (ISSASIP1615).
Materials
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
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