Colección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) en la producción de metabolitos
Summary
La secreción de exudados radiculares suele ser una estrategia de desintoxicación externa para las plantas en condiciones de estrés. Este protocolo describe cómo evaluar el impacto de los xenobióticos en la alfalfa a través del análisis metabolómico no dirigido.
Abstract
Los exudados de raíces son el principal medio de comunicación de información y transferencia de energía entre las raíces de las plantas y el entorno circundante. El cambio en la secreción de exudados radiculares suele ser una estrategia de desintoxicación externa para las plantas en condiciones de estrés. Este protocolo tiene como objetivo introducir directrices generales para la recolección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del ftalato de di (2-etilhexilo) (DEHP) en la producción de metabolitos. Primero, las plántulas de alfalfa se cultivan bajo estrés DEHP en un experimento de cultivo hidropónico. En segundo lugar, las plantas se transfieren a tubos de centrífuga que contienen 50 ml de agua ultrapura esterilizada durante 6 h para recoger los exudados de la raíz. Las soluciones se liofilizan en un liofilizador al vacío. Las muestras congeladas se extraen y se derivatizan con el reactivo bis(trimetilsilil)) trifluoroacetamida (BSTFA). Posteriormente, los extractos derivatizados se miden utilizando un sistema de cromatógrafo de gases acoplado con un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo (GC-TOF-MS). Los datos de metabolitos adquiridos se analizan en base a métodos bioinformáticos. Los metabolitos diferenciales y las vías metabólicas significativamente modificadas deben explorarse profundamente para revelar el impacto del DEHP en la alfalfa en vista de los exudados de la raíz.
Introduction
El ftalato de di (2-etilhexilo) (DEHP) es un compuesto químico sintético que se usa ampliamente en varios plásticos y polímeros como plastificante para mejorar su plasticidad y resistencia. En los últimos años, un número creciente de estudios han sugerido que el DEHP es un disruptor endocrino y tiene efectos adversos sobre los sistemas respiratorio, nervioso y reproductivo de los seres humanos y otros animales 1,2,3. Teniendo en cuenta su riesgo para la salud, la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos, la Unión Europea y el Centro de Monitoreo Ambiental de China han clasificado el DEHP en la lista de contaminantes prioritarios. El suelo ha sido considerado como un importante sumidero de DEHP en el medio ambiente, debido a la aplicación de mantillo plástico y fertilizantes orgánicos, riego con aguas residuales y aplicación de lodos agrícolas4. Como era de esperar, el DEHP se ha detectado ubicuamente en suelos de tierras de cultivo, cuyo contenido incluso alcanza hasta miligramos por kilogramo de suelo seco en algunas regiones de China 5,6. El DEHP puede ingresar a las plantas principalmente a través de las raíces y sufrir biomagnificación a diferentes niveles tróficos en los ecosistemas del suelo7. Por lo tanto, se ha planteado una preocupación significativa sobre el estrés inducido por el DEHP en las plantas en las últimas décadas.
Las plantas suelen ser vulnerables a la exposición al DEHP. Se ha observado que el estrés del DEHP ejerce un efecto adverso sobre la germinación de las semillas y el metabolismo normal, inhibiendo así el crecimiento y desarrollo de las plantas 8,9. Por ejemplo, el DEHP puede inducir daño oxidativo a las células del mesófilo, disminuir el contenido de clorofila y osmolitos, y elevar las actividades de las enzimas antioxidantes, lo que eventualmente resulta en una disminución en el rendimiento y la calidad de las plantas comestibles10,11. Sin embargo, la mayoría de los estudios previos sobre la respuesta de las plantas al estrés del DEHP se han centrado en el estrés oxidativo y las características fisiológicas y bioquímicas. Los mecanismos correspondientes asociados con el metabolismo de las plantas están menos estudiados. Exudados de raíz es un término genérico que describe compuestos que las raíces de las plantas secretan y liberan en el medio ambiente. Han sido considerados como el medio de interacción entre las plantas y el suelo de la rizosfera, desempeñando un papel importante en el apoyo al crecimiento y desarrollo de las plantas12. Es bien sabido que los exudados de la raíz representan aproximadamente el 30%-40% de todo el carbono fotosintético13. En ambientes contaminados, los exudados radiculares están involucrados en la mejora de la tolerancia de las plantas al estrés de los contaminantes a través del metabolismo o la exclusión externa14. Como consecuencia, una comprensión profunda de la respuesta de los exudados de las raíces de las plantas al estrés por contaminación puede ayudar a revelar los mecanismos subyacentes asociados con la bioquímica celular y los fenómenos biológicos15.
La tecnología metabolómica proporciona una estrategia eficiente para medir un gran número de metabolitos de moléculas pequeñas simultáneamente dentro de las células 16,17, tejidos18 e incluso exudados de organismos 19, incluidos azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos y lípidos. En comparación con los métodos de análisis químico tradicionales o clásicos, el enfoque metabolómico aumenta en gran medida el número de metabolitos que se pueden detectar20, lo que puede ayudar a identificar metabolitos de una manera de mayor rendimiento e identificar vías metabólicas clave. La metabolómica ha sido ampliamente utilizada en el campo de investigación de la respuesta biológica en ambientes de estrés, como metales pesados21, contaminantes emergentes22 y nanopartículas19. La mayoría de estos estudios en plantas se han centrado en los cambios metabólicos en los tejidos interiores de las plantas, mientras que pocos se han reportado sobre la respuesta de los exudados de las raíces al estrés ambiental. Por lo tanto, el objetivo de este estudio es introducir pautas generales para la recolección de exudados de raíz de alfalfa para estudiar el impacto del DEHP en la producción de metabolitos. Los resultados proporcionarán una guía metodológica para el estudio de seguimiento de la metabolómica vegetal por DEHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona orientación general sobre cómo recolectar y medir los exudados de la raíz de la alfalfa bajo estrés DEHP, así como sobre cómo analizar los datos del metaboloma. Se debe prestar mucha atención a algunos pasos críticos en este protocolo. En experimentos de cultivo hidropónico, las plántulas de alfalfa se cultivaron hidropónicamente en botellas de vidrio llenas de soluciones nutritivas con diferentes concentraciones de DEHP. Las botellas de vidrio deben protegerse de la luz cubriéndola…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado conjuntamente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (41877139), los Grandes Proyectos de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (41991335), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2016YFD0800204), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (No. BK20161616), el Plan “135” y el Programa de Fronteras de la Academia China de Ciencias (ISSASIP1615).
Materials
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
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