Summary

Collecte d’exsudats de racines de luzerne pour étudier l’impact du phtalate de di(2-éthylhexyle) sur la production de métabolites

Published: June 02, 2023
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Summary

La sécrétion d’exsudats racinaires est généralement une stratégie de désintoxication externe pour les plantes dans des conditions de stress. Ce protocole décrit comment évaluer l’impact des xénobiotiques sur la luzerne par analyse métabolomique non ciblée.

Abstract

Les exsudats racinaires sont les principaux moyens de communication de l’information et de transfert d’énergie entre les racines des plantes et le milieu environnant. Le changement dans la sécrétion des exsudats racinaires est généralement une stratégie de désintoxication externe pour les plantes dans des conditions de stress. Ce protocole vise à introduire des lignes directrices générales pour la collecte d’exsudats de racines de luzerne afin d’étudier l’impact du phtalate de di(2-éthylhexyle) (DEHP) sur la production de métabolites. Tout d’abord, les semis de luzerne sont cultivés sous stress DEHP dans une expérience de culture hydroponique. Deuxièmement, les plantes sont transférées dans des tubes de centrifugation contenant 50 mL d’eau ultrapure stérilisée pendant 6 h pour recueillir les exsudats racinaires. Les solutions sont ensuite lyophilisées dans un lyophilisateur sous vide. Les échantillons congelés sont extraits et dérivatisés avec le réactif bis(triméthylsilyl)) trifluoroacétamide (BSTFA). Par la suite, les extraits dérivatisés sont mesurés à l’aide d’un système de chromatographe en phase gazeuse couplé à un spectromètre de masse à temps de vol (GC-TOF-MS). Les données sur les métabolites acquis sont ensuite analysées selon des méthodes bioinformatiques. Les métabolites différentiels et les voies métaboliques significativement modifiées devraient être explorés en profondeur pour révéler l’impact du DEHP sur la luzerne compte tenu des exsudats racinaires.

Introduction

Le phtalate de di(2-éthylhexyle) (DEHP) est un composé chimique synthétique largement utilisé dans divers plastiques et polymères comme plastifiant pour améliorer leur plasticité et leur résistance. Au cours des dernières années, un nombre croissant d’études ont suggéré que le DEHP est un perturbateur endocrinien et a des effets néfastes sur les systèmes respiratoire, nerveux et reproducteur des humains et des autres animaux 1,2,3. Compte tenu de son risque pour la santé, l’Agence de protection de l’environnement des États-Unis, l’Union européenne et le Centre de surveillance environnementale de Chine ont tous classé le DEHP dans la liste des polluants prioritaires. Le sol a été considéré comme un puits important de DEHP dans l’environnement, en raison de l’application de paillage plastique et d’engrais organiques, de l’irrigation avec des eaux usées et de l’application de bouesagricoles 4. Comme prévu, le DEHP a été détecté de manière omniprésente dans les sols des terres agricoles, dont la teneur atteint même jusqu’à milligrammes par kilogramme de sol séché dans certaines régions de Chine 5,6. Le DEHP peut pénétrer dans les plantes principalement par les racines et subir une bioamplification à différents niveaux trophiques dans les écosystèmes du sol7. Par conséquent, au cours des dernières décennies, des préoccupations importantes ont été soulevées au sujet du stress induit par le DEHP dans les usines.

Les plantes sont généralement vulnérables à l’exposition au DEHP. Il a été observé que le stress du DEHP exerce un effet néfaste sur la germination des graines et le métabolisme normal, inhibant ainsi la croissance et le développement des plantes 8,9. Par exemple, le DEHP peut induire des dommages oxydatifs aux cellules mésophylles, diminuer la teneur en chlorophylle et en osmolytes, et élever les activités enzymatiques antioxydantes, entraînant éventuellement une baisse du rendement et de la qualité des plantes comestibles10,11. Cependant, la plupart des études antérieures sur la réponse des plantes au stress du DEHP se sont concentrées sur le stress oxydatif et les caractéristiques physiologiques et biochimiques. Les mécanismes correspondants associés au métabolisme des plantes sont moins étudiés. Les exsudats racinaires sont un terme générique décrivant les composés que les racines des plantes sécrètent et libèrent dans l’environnement. Ils ont été considérés comme les milieux d’interaction entre les plantes et le sol de la rhizosphère, jouant un rôle important dans le soutien de la croissance et du développementdes plantes 12. Il est bien connu que les exsudats racinaires représentent environ 30% à 40% de tout le carbone photosynthétique13. Dans les milieux pollués, les exsudats racinaires sont impliqués dans l’amélioration de la tolérance des plantes au stress des polluants par métabolisme ou exclusion externe14. En conséquence, une compréhension approfondie de la réponse des exsudats racinaires des plantes au stress de pollution peut aider à révéler les mécanismes sous-jacents associés à la biochimie cellulaire et aux phénomènes biologiques15.

La technologie métabolomique fournit une stratégie efficace pour mesurer un grand nombre de métabolites de petites molécules simultanément dans les cellules 16,17, les tissus18, et même les exsudats d’organismes 19, y compris les sucres, les acides organiques, les acides aminés et les lipides. Par rapport aux méthodes d’analyse chimique traditionnelles ou classiques, l’approche métabolomique augmente considérablement le nombre de métabolites pouvant être détectés20, ce qui peut aider à identifier les métabolites de manière plus débitée et à identifier les voies métaboliques clés. La métabolomique a été largement utilisée dans le domaine de la recherche sur la réponse biologique dans les environnements de stress, tels que les métaux lourds21, les polluants émergents22 et les nanoparticules19. La plupart de ces études sur les plantes se sont concentrées sur les changements métaboliques dans les tissus végétaux intérieurs, alors que peu ont été rapportées sur la réponse des exsudats racinaires au stress environnemental. Par conséquent, le but de cette étude est d’introduire des lignes directrices générales pour la collecte d’exsudats de racines de luzerne afin d’étudier l’impact du DEHP sur la production de métabolites. Les résultats fourniront une orientation méthodologique pour l’étude de suivi de la métabolomique végétale par le DEHP.

Protocol

L’objectif de ce protocole est de fournir un pipeline général, d’une expérience de culture hydroponique à l’analyse métabolomique, quantifiant l’effet du DEHP sur les exsudats de racines de luzerne. 1. Expérience de culture hydroponique REMARQUE : Ce protocole présente un exemple d’expérience de culture hydroponique de luzerne conçue pour obtenir des semis de luzerne (Medicago sativa) sous le stress de différentes concentr…

Representative Results

Dans cette expérience, des exsudats de racines de luzerne ont été recueillis, extraits et analysés selon les méthodes ci-dessus (figure 1). Trois groupes de traitement ont été mis en place : témoin, faible concentration de DEHP (1 mg L-1) et concentration élevée de DEHP (10 mg L-1). Au total, 778 pics ont été détectés dans le chromatographe du témoin, dont 314 métabolites ont pu être identifiés en fonction des spectres de ma…

Discussion

Ce protocole fournit des conseils généraux sur la façon de recueillir et de mesurer les exsudats racinaires de luzerne sous stress DEHP, ainsi que sur la façon d’analyser les données du métabolome. Une attention particulière doit être accordée à certaines étapes critiques de ce protocole. Dans les expériences de culture hydroponique, les semis de luzerne ont été cultivés hydroponiquement dans des bouteilles en verre remplies de solutions nutritives avec différentes concentrations de DEHP. Les bouteilles…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu conjointement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (41877139), les grands projets de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (41991335), le Programme national clé de recherche et de développement de Chine (2016YFD0800204), la Fondation des sciences naturelles de la province du Jiangsu (n ° BK20161616), le Plan « 135 » et le Programme des frontières de l’Académie chinoise des sciences (ISSASIP1615).

Materials

Adonitol SIGMA ≥99%
Alfalfa seeds Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China)
Analytical balance Sartorius BSA124S-CW
BSTFA REGIS Technologies with 1% TMCS, v/v
Centrifuge Thermo Fisher Scientific Heraeus Fresco17
Chromatographic column Agilent DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm)
Di(2-ethylhexyl) phthalate Dr. Ehrenstorfer
FAMEs Dr. Ehrenstorfer
Gas chromatography(GC) Agilent 7890A
Grinding instrument Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd JXFSTPRP-24
Mass spectrometer(MS) LECO PEGASUS HT
Methanol CNW Technologies HPLC
Methoxyaminatio hydrochloride TCI AR
Microcentrifuge tube Eppendorf Eppendorf Quality 1.5 mL
Oven Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd DHG-9023A
Pyridine Adamas HPLC
R software statistical analysis software (pathway enrichment, topology)
SIMCA16.0.2  statistical analysis software (OPLS-DA etc)
Ultra low temperature freezer Thermo Fisher Scientific Forma 900 series
Ultrasound Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd YM-080S
Vacuum dryer Taicang Huamei biochemical instrument factory LNG-T98

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Cite This Article
Ren, W., Zhao, R., Teng, Y., Luo, Y. Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production. J. Vis. Exp. (196), e64470, doi:10.3791/64470 (2023).

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