مجموعة من إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات على إنتاج الأيض
Summary
عادة ما يكون إفراز إفرازات الجذر استراتيجية خارجية لإزالة السموم للنباتات تحت ظروف الإجهاد. يصف هذا البروتوكول كيفية تقييم تأثير xenobiotics على البرسيم من خلال التحليل الأيضي غير المستهدف.
Abstract
إفرازات الجذر هي الوسائط الرئيسية لتوصيل المعلومات ونقل الطاقة بين جذور النباتات والبيئة المحيطة. عادة ما يكون التغيير في إفراز إفرازات الجذر استراتيجية خارجية لإزالة السموم للنباتات في ظل ظروف الإجهاد. يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم إرشادات عامة لجمع إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات (DEHP) على إنتاج المستقلب. أولا ، تزرع شتلات البرسيم تحت ضغط DEHP في تجربة الاستزراع المائي. ثانيا ، يتم نقل النباتات إلى أنابيب طرد مركزي تحتوي على 50 مل من الماء المعقم عالي النقاء لمدة 6 ساعات لجمع إفرازات الجذر. ثم يتم تجفيف المحاليل بالتجميد في مجفف تجميد بالفراغ. يتم استخراج العينات المجمدة واشتقاقها باستخدام كاشف ثنائي (ثلاثي ميثيل سيليل)) ثلاثي فلورو أسيتاميد (BSTFA). بعد ذلك ، يتم قياس المستخلصات المشتقة باستخدام نظام كروماتوجراف الغاز إلى جانب مطياف كتلة وقت الرحلة (GC-TOF-MS). ثم يتم تحليل بيانات الأيض المكتسبة بناء على طرق المعلوماتية الحيوية. يجب استكشاف المستقلبات التفاضلية ومسارات التمثيل الغذائي المتغيرة بشكل كبير للكشف عن تأثير DEHP على البرسيم في ضوء إفرازات الجذر.
Introduction
Di (2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) هو مركب كيميائي اصطناعي يستخدم على نطاق واسع في العديد من المواد البلاستيكية والبوليمرات كملدنات لتحسين اللدونة والقوة. في السنوات القليلة الماضية ، اقترح عدد متزايد من الدراسات أن DEHP هو اضطراب الغدد الصماء وله تأثير سلبي على الجهاز التنفسي والعصبي والتناسلي للبشر والحيوانات الأخرى1،2،3. بالنظر إلى المخاطر الصحية ، صنفت وكالة حماية البيئة الأمريكية والاتحاد الأوروبي ومركز المراقبة البيئية في الصين DEHP في قائمة الملوثات ذات الأولوية. تعتبر التربة بالوعة مهمة ل DEHP في البيئة ، بسبب استخدام التغطية البلاستيكية والأسمدة العضوية ، والري بمياه الصرف الصحي ، وتطبيق مزرعة الحمأة4. كما هو متوقع ، تم اكتشاف DEHP في كل مكان في تربة الأراضي الزراعية ، والتي يصل محتواها إلى ملليغرام لكل كيلوغرام من التربة المجففة في بعض المناطق في الصين 5,6. يمكن أن يدخل DEHP النباتات بشكل رئيسي عن طريق الجذور ويخضع للتضخم الأحيائي على مستويات غذائية مختلفة في النظم الإيكولوجية للتربة7. لذلك ، أثير قلق كبير بشأن الإجهاد الناجم عن DEHP في النباتات على مدى العقود الأخيرة.
عادة ما تكون النباتات عرضة للتعرض ل DEHP. لوحظ أن إجهاد DEHP له تأثير سلبي على إنبات البذور والتمثيل الغذائي الطبيعي ، وبالتالي يمنع نمو النبات وتطوره 8,9. على سبيل المثال ، يمكن أن يؤدي DEHP إلى حدوث ضرر تأكسدي لخلايا الميزوفيل ، وتقليل محتويات الكلوروفيل والأوسموليت ، ورفع أنشطة الإنزيم المضاد للأكسدة ، مما يؤدي في النهاية إلى انخفاض في إنتاجية وجودة النباتات الصالحة للأكل10,11. ومع ذلك ، فإن معظم الدراسات السابقة حول استجابة النباتات لإجهاد DEHP قد ركزت على الإجهاد التأكسدي والخصائص الفسيولوجية والكيميائية الحيوية. الآليات المقابلة المرتبطة بعملية التمثيل الغذائي للنبات أقل دراسة. إفرازات الجذر مصطلح عام يصف المركبات التي تفرزها جذور النباتات وتطلقها في البيئة. وقد تم اعتبارها وسائط تفاعل بين النباتات وتربة الجذور ، وتلعب دورا مهما في دعم نمو النبات وتطوره12. من المعروف جيدا أن إفرازات الجذر تمثل حوالي 30٪ -40٪ من جميع الكربون الضوئي13. في البيئات الملوثة ، تشارك إفرازات الجذر في تحسين تحمل النباتات لإجهاد الملوثات من خلال التمثيل الغذائي أو الاستبعاد الخارجي14. نتيجة لذلك ، قد يساعد الفهم العميق لاستجابة إفرازات جذور النبات لإجهاد التلوث في الكشف عن الآليات الأساسية المرتبطة بالكيمياء الحيوية للخلايا والظواهر البيولوجية15.
توفر تقنية الأيض استراتيجية فعالة لقياس عدد كبير من مستقلبات الجزيئات الصغيرة في وقت واحد داخل الخلايا 16,17 ، والأنسجة18 ، وحتى إفرازات الكائناتالحية 19 ، بما في ذلك السكريات والأحماض العضوية والأحماض الأمينية والدهون. بالمقارنة مع طرق التحليل الكيميائي التقليدية أو الكلاسيكية ، فإن نهج الأيض يزيد بشكل كبير من عدد المستقلبات التي يمكن اكتشافها20 ، والتي يمكن أن تساعد في تحديد المستقلبات بطريقة إنتاجية أعلى وتحديد المسارات الأيضية الرئيسية. تم استخدام الأيض على نطاق واسع في مجال أبحاث الاستجابة البيولوجية في بيئات الإجهاد ، مثل المعادن الثقيلة21 ، والملوثات الناشئة22 ، والجسيمات النانوية19. ركزت معظم هذه الدراسات على النباتات على التغيرات الأيضية في الأنسجة النباتية الداخلية ، في حين تم الإبلاغ عن القليل منها حول استجابة إفرازات الجذر للإجهاد البيئي. لذلك ، فإن الهدف من هذه الدراسة هو تقديم إرشادات عامة لجمع إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير DEHP على إنتاج الأيض. ستوفر النتائج إرشادات طريقة لدراسة متابعة الأيض النباتي بواسطة DEHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول إرشادات عامة حول كيفية جمع وقياس إفرازات جذر البرسيم تحت ضغط DEHP ، وكذلك كيفية تحليل بيانات الأيض. يجب إيلاء اهتمام وثيق لبعض الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. في تجارب الاستزراع المائي ، تم استزراع شتلات البرسيم في الماء في زجاجات زجاجية مملوءة بمحاليل مغذية بتركيزات…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بشكل مشترك من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (41877139) ، والمشاريع الرئيسية للمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (41991335) ، والبرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2016YFD0800204) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (رقم BK20161616) ، وخطة “135” ، وبرنامج الحدود للأكاديمية الصينية للعلوم (ISSASIP1615).
Materials
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
References
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
- van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
- Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
- Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
- Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
- Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
- Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
- Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
- Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
- Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
- Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
- Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
- vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
- Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
- Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
- Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
- Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
- Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
- Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
- Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
- Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
- Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
- van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
- Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , 319-321 (2003).
- Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
- Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
- Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
- Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
- Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).
