Verzameling van alfalfawortelexsudaten om de impact van di (2-ethylhexyl) ftalaat op de productie van metabolieten te bestuderen
Summary
De afscheiding van wortelexsudaten is meestal een externe ontgiftingsstrategie voor planten onder stressomstandigheden. Dit protocol beschrijft hoe de impact van xenobiotica op alfalfa kan worden beoordeeld via niet-gerichte metabolomische analyse.
Abstract
Wortelexsudaten zijn de belangrijkste media van informatiecommunicatie en energieoverdracht tussen plantenwortels en de omgeving. De verandering in afscheiding van wortelexsudaten is meestal een externe ontgiftingsstrategie voor planten onder stressomstandigheden. Dit protocol heeft tot doel algemene richtlijnen in te voeren voor het verzamelen van alfalfawortelexsudaten om de impact van di(2-ethylhexyl)ftalaat (DEHP) op de productie van metabolieten te bestuderen. Ten eerste worden alfalfa-zaailingen gekweekt onder DEHP-stress in een hydroponisch cultuurexperiment. Ten tweede worden de planten overgebracht naar centrifugebuizen met 50 ml gesteriliseerd ultrapuur water gedurende 6 uur om wortelexsudaten te verzamelen. De oplossingen worden vervolgens gevriesdroogd in een vacuümvriesdroger. De ingevroren monsters worden geëxtraheerd en gederivatiseerd met bis (trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA) reagens. Vervolgens worden de gederivatiseerde extracten gemeten met behulp van een gaschromatograafsysteem gekoppeld aan een time-of-flight massaspectrometer (GC-TOF-MS). De verkregen metabolietgegevens worden vervolgens geanalyseerd op basis van bioinformatische methoden. Differentiële metabolieten en significant veranderde metabolismeroutes moeten grondig worden onderzocht om de impact van DEHP op alfalfa te onthullen met het oog op wortelexsudaten.
Introduction
Di (2-ethylhexyl) ftalaat (DEHP) is een synthetische chemische verbinding die veel wordt gebruikt in verschillende kunststoffen en polymeren als weekmaker om hun plasticiteit en sterkte te verbeteren. In de afgelopen jaren hebben steeds meer studies gesuggereerd dat DEHP een hormoonontregelaar is en een nadelig effect heeft op de ademhalings-, zenuw- en voortplantingssystemen van mensen en andere dieren 1,2,3. Gezien het gezondheidsrisico hebben het Environmental Protection Agency van de Verenigde Staten, de Europese Unie en het Environmental Monitoring Center of China allemaal DEHP geclassificeerd in de lijst met prioritaire verontreinigende stoffen. De bodem wordt beschouwd als een belangrijke put van DEHP in het milieu, vanwege de toepassing van plastic mulchen en organische meststoffen, irrigatie met afvalwater en toepassing van slibbedrijven4. Zoals verwacht is DEHP alomtegenwoordig gedetecteerd in landbouwgronden, waarvan het gehalte in sommige regio’s in China zelfs tot milligram per kilogram gedroogde grond reikt 5,6. DEHP kan planten voornamelijk via de wortels binnendringen en biomagnificatie ondergaan op verschillende trofische niveaus in bodemecosystemen7. Daarom is er de afgelopen decennia grote bezorgdheid geuit over door DEHP veroorzaakte stress in planten.
Planten zijn meestal kwetsbaar voor DEHP-blootstelling. Van DEHP-stress is waargenomen dat het een nadelig effect heeft op de kieming van zaden en het normale metabolisme, waardoor de groei en ontwikkeling van planten wordt geremd 8,9. DEHP kan bijvoorbeeld oxidatieve schade aan mesofylcellen veroorzaken, het gehalte aan chlorofyl en osmolyten verlagen en antioxidatieve enzymactiviteiten verhogen, wat uiteindelijk resulteert in een afname van de opbrengst en kwaliteit van eetbare planten10,11. De meeste eerdere studies over de reactie van planten op DEHP-stress hebben zich echter gericht op oxidatieve stress en fysiologische en biochemische kenmerken. De overeenkomstige mechanismen die verband houden met het metabolisme van planten zijn minder bestudeerd. Wortelexsudaten is een algemene term die verbindingen beschrijft die plantenwortels afscheiden en afgeven in het milieu. Ze worden beschouwd als de interactiemedia tussen planten en rhizosfeergrond en spelen een belangrijke rol bij het ondersteunen van plantengroei en -ontwikkeling12. Het is bekend dat wortelexsudaten goed zijn voor ongeveer 30% -40% van alle fotosynthetische koolstof13. In vervuilde omgevingen zijn wortelexsudaten betrokken bij het verbeteren van de tolerantie van planten voor de stress van verontreinigende stoffen door metabolisme of externe uitsluiting14. Als gevolg hiervan kan een diepgaand begrip van de reactie van plantenwortelexsudaten op vervuilingsstress helpen bij het onthullen van de onderliggende mechanismen die verband houden met celbiochemie en biologische verschijnselen15.
Metabolomics-technologie biedt een efficiënte strategie voor het gelijktijdig meten van een groot aantal metabolieten van kleine moleculen in cellen 16,17, weefsels18 en zelfs exsudaten van organismen 19, waaronder suikers, organische zuren, aminozuren en lipiden. In vergelijking met traditionele of klassieke chemische analysemethoden verhoogt de metabolomics-benadering het aantal metabolieten dat kan worden gedetecteerd20, wat kan helpen bij het identificeren van metabolieten op een manier met een hogere doorvoer en het identificeren van belangrijke metabole routes. Metabolomics is op grote schaal gebruikt in het onderzoeksgebied van biologische respons in stressomgevingen, zoals zware metalen21, opkomende verontreinigende stoffen22 en nanodeeltjes19. De meeste van deze studies op planten hebben zich gericht op de metabole veranderingen in inwendige plantenweefsels, terwijl er weinig zijn gerapporteerd over de reactie van wortelexsudaten op omgevingsstress. Daarom is het doel van deze studie om algemene richtlijnen te introduceren voor het verzamelen van alfalfawortelexsudaten om de impact van DEHP op de productie van metabolieten te bestuderen. De resultaten zullen een methodeleidraad bieden voor de vervolgstudie van plantenmetabolomica door DEHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt algemene richtlijnen voor het verzamelen en meten van de wortelexsudaten van alfalfa onder DEHP-stress, evenals voor het analyseren van de metaboloomgegevens. Er moet veel aandacht worden besteed aan enkele kritieke stappen in dit protocol. In hydroponische cultuurexperimenten werden alfalfa-zaailingen hydroponisch gekweekt in glazen flessen gevuld met voedingsoplossingen met verschillende concentraties DEHP. De glazen flessen moeten worden beschermd tegen licht door ze gedurende de hele kweekperiode m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gezamenlijk ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (41877139), de Major Projects van de National Natural Science Foundation of China (41991335), het National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), de Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20161616), het “135” Plan en het Frontiers Program van de Chinese Academy of Sciences (ISSASIP1615).
Materials
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
References
- Yin, X. H., Zeb, R., Wei, H., Cai, L. Acute exposure of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) induces immune signal regulation and ferroptosis in oryzias melastigma. Chemosphere. 265, 129053 (2021).
- Seyoum, A., Pradhan, A. Effect of phthalates on development, reproduction, fat metabolism and lifespan in Daphnia magna. The Science of the Total Environment. 654, 969-977 (2019).
- van T Erve, T. J., et al. Phthalates and phthalate alternatives have diverse associations with oxidative stress and inflammation in pregnant women. Environmental Science & Technology. 53 (6), 3258-3267 (2019).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: an investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Li, K. K., Ma, D., Wu, J., Chai, C., Shi, Y. X. Distribution of phthalate esters in agricultural soil with plastic film mulching in Shandong Peninsula, East China. Chemosphere. 164, 314-321 (2016).
- Sun, J., Wu, X., Gan, J. Uptake and metabolism of phthalate esters by edible plants. Environmental Science & Technology. 49 (14), 8471-8478 (2015).
- Kim, D., Cui, R., Moon, J., Kwak, J. I., An, Y. J. Soil ecotoxicity study of DEHP with respect to multiple soil species. Chemosphere. 216, 387-395 (2019).
- Gao, M. L., Qi, Y., Song, W. H., Xu, H. R. Effects of di-n-butyl phthalate and di (2-ethylhexyl) phthalate on the growth, photosynthesis, and chlorophyll fluorescence of wheat seedlings. Chemosphere. 151, 76-83 (2016).
- Zhang, Y., et al. Effects of diethylphthalate and di-(2-ethyl)hexylphthalate on the physiology and ultrastructure of cucumber seedlings. Environmental Science and Pollution Research. 21 (2), 1020-1028 (2014).
- Gao, M. L., Liu, Y., Dong, Y. M., Song, Z. G. Physiological responses of wheat planted in fluvo-aquic soils to di (2-ethylhexyl) and di-n-butyl phthalates. Environmental Pollution. 244, 774-782 (2019).
- Lundberg, D. S., Teixeira, P. J. P. L. Root-exuded coumarin shapes the root microbiome. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5629-5631 (2018).
- Canarini, A., Kaiser, C., Merchant, A., Richter, A., Wanek, W. Root exudation of primary metabolites: mechanisms and their roles in plant responses to environmental stimuli. Frontiers in Plant Science. 10, 157 (2019).
- Chai, Y. N., Schachtman, D. P. Root exudates impact plant performance under abiotic stress. Trends in Plant Science. 27 (1), 80-91 (2022).
- Olanrewaju, O. S., Ayangbenro, A. S., Glick, B. R., Babalola, O. O. Plant health: feedback effect of root exudates-rhizobiome interactions. Applied Microbiology and Biotechnology. 103 (3), 1155-1166 (2019).
- Chamberlain, C. A., Hatch, M., Garrett, T. J. Metabolomic and lipidomic characterization of Oxalobacter formigenes strains HC1 and OxWR by UHPLC-HRMS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (19), 4807-4818 (2019).
- vander Hooft, J. J. J., Goldstone, R. J., Harris, S., Burgess, K. E. V., Smith, D. G. E. Substantial extracellular metabolic differences found between phylogenetically closely related probiotic and pathogenic strains of Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 10, 252 (2019).
- Liu, N., Zhu, L. Metabolomic and transcriptomic investigation of metabolic perturbations in Oryza sativa L. triggered by three pesticides. Environmental Science & Technology. 54 (10), 6115-6124 (2020).
- Zhao, L., et al. H-1 NMR and GC-MS based metabolomics reveal defense and detoxification mechanism of cucumber plant under nano-Cu stress. Environmental Science & Technology. 50 (4), 2000-2010 (2016).
- Llanes, A., Arbona, V., Gómez-Cadenas, A., Luna, V. Metabolomic profiling of the halophyte Prosopis strombulifera shows sodium salt- specific response. Plant Physiology and Biochemistry. 108, 145-157 (2016).
- Zhang, Y., et al. Zinc stress affects ionome and metabolome in tea plants. Plant Physiology and Biochemistry. 111, 318-328 (2017).
- Wright, R. J., Bosch, R., Gibson, M. I., Christie-Oleza, J. A. Plasticizer degradation by marine bacterial isolates: a proteogenomic and metabolomic characterization. Environmental Science & Technology. 54 (4), 2244-2256 (2020).
- He, L., et al. Contamination and remediation of phthalic acid esters in agricultural soils in China: a review. Agronomy for Sustainable Development. 35 (2), 519-534 (2015).
- Koch, K. E. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 47, 509-540 (1996).
- Wang, Y. T., et al. Nontargeted metabolomic analysis to unravel the impact of di (2-ethylhexyl) phthalate stress on root exudates of alfalfa (Medicago sativa). The Science of the Total Environment. 646, 212-219 (2019).
- Yu, Q., et al. Photolysis of bis(2-ethylhexyl) phthalate in aqueous solutions at the presence of natural water photoreactive constituents under simulated sunlight irradiation. Environmental Science and Pollution Research International. 26 (26), 26797-26806 (2019).
- Zhang, S. H., Guo, A. J., Fan, T. T., Zhang, R., Niu, Y. J. Phthalates in residential and agricultural soils from an electronic waste-polluted region in South China: distribution, compositional profile and sources. Environmental Science and Pollution Research. 26 (12), 12227-12236 (2019).
- Liu, S. S., et al. Di-(2-ethylhexyl) phthalate as a chemical indicator for phthalic acid esters: An investigation into phthalic acid esters in cultivated fields and e-waste dismantling sites. Environmental Toxicology and Chemistry. 38 (5), 1132-1141 (2019).
- Fan, T. W., Lane, A. N., Pedler, J., Crowley, D., Higashi, R. M. Comprehensive analysis of organic ligands in whole root exudates using nuclear magnetic resonance and gas chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 251 (1), 57-68 (1997).
- Bobille, H., et al. Evolution of the amino acid fingerprint in the unsterilized rhizosphere of a legume in relation to plant maturity. Soil Biology and Biochemistry. 101, 226-236 (2016).
- Zhang, Z., et al. Effects of two root-secreted phenolic compounds from a subalpine coniferous species on soil enzyme activity and microbial biomass. Chemistry and Ecology. 31 (7), 636-649 (2015).
- Yuan, J., et al. Organic acids from root exudates of banana help root colonization of PGPR strain Bacillus amyloliquefaciens NJN-6. Scientific Reports. 5, 13438 (2015).
- van Dam, N. M., Bouwmeester, H. J. Metabolomics in the rhizosphere: tapping into belowground chemical communication. Trends in Plant Science. 21 (3), 256-265 (2016).
- Shen, X., Yang, F., Xiao, C., Zhou, Y. Increased contribution of root exudates to soil carbon input during grassland degradation. Soil Biology & Biochemistry. 146, 107817 (2020).
- Oburger, E., Jones, D. L. Sampling root exudates-mission impossible. Rhizosphere. 6, 116-133 (2018).
- Zhang, L. Effects of root exudates of wheat stressed by Cd on the germination of crop seeds. International Symposium on Water Resources and the Urban Environment. , 319-321 (2003).
- Shinano, T., et al. Metabolomic analysis of night-released soybean root exudates under high- and low-K conditions. Plant and Soil. 456, 259-276 (2020).
- Adeleke, R., Nwangburuka, C., Oboirien, B. Origins, roles and fate of organic acids in soils: A review. South African Journal of Botany. 108, 393-406 (2017).
- Rico, C. M., et al. Cerium oxide nanoparticles modify the antioxidative stress enzyme activities and macromolecule composition in rice seedlings. Environmental Science & Technology. 47 (24), 14110-14118 (2013).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Vodovnik, M., Marinsek-Logar, R., Kahru, A. Exposure to CuO nanoparticles changes the fatty acid composition of protozoa Tetrahymena thermophila. Environmental Science & Technology. 45 (15), 6617-6624 (2011).
- Liao, Q. H., et al. Root exudates enhance the PAH degradation and degrading gene abundance in soils. Science of the Total Environment. 764, 144436 (2021).
- Ding, Y., et al. Adaptive defence and sensing responses of host plant roots to fungal pathogen attack revealed by transcriptome and metabolome analyses. Plant, Cell & Environment. 44 (12), 3526-3544 (2021).
- Rugova, A., Puschenreiter, M., Koellensperger, G., Hann, S. Elucidating rhizosphere processes by mass spectrometry-A review. Analytica Chimica Acta. 956, 1-13 (2017).
