Raccolta di essudati di radice di erba medica per studiare l'impatto del di(2-etilesil) ftalato sulla produzione di metaboliti
Summary
La secrezione di essudati radicali è di solito una strategia di disintossicazione esterna per le piante in condizioni di stress. Questo protocollo descrive come valutare l’impatto degli xenobiotici sull’erba medica attraverso un’analisi metabolomica non mirata.
Abstract
Gli essudati radicali sono i principali mezzi di comunicazione delle informazioni e di trasferimento di energia tra le radici delle piante e l’ambiente circostante. Il cambiamento nella secrezione degli essudati radicali è di solito una strategia di disintossicazione esterna per le piante in condizioni di stress. Questo protocollo mira a introdurre linee guida generali per la raccolta di essudati di radice di erba medica per studiare l’impatto del bis (2-etilesil) ftalato (DEHP) sulla produzione di metaboliti. In primo luogo, le piantine di erba medica vengono coltivate sotto stress DEHP in un esperimento di coltura idroponica. In secondo luogo, le piante vengono trasferite in provette da centrifuga contenenti 50 ml di acqua ultrapura sterilizzata per 6 ore per raccogliere gli essudati radicali. Le soluzioni vengono quindi liofilizzate in un liofilizzatore sottovuoto. I campioni congelati vengono estratti e derivati con il reagente bis(trimetilsilil)) trifluoroacetammide (BSTFA). Successivamente, gli estratti derivati vengono misurati utilizzando un sistema gascromatografico accoppiato con uno spettrometro di massa a tempo di volo (GC-TOF-MS). I dati dei metaboliti acquisiti vengono quindi analizzati sulla base di metodi bioinformatici. I metaboliti differenziali e le vie metaboliche significativamente modificate dovrebbero essere esplorati a fondo per rivelare l’impatto del DEHP sull’erba medica in vista degli essudati radicali.
Introduction
Il di(2-etilesil) ftalato (DEHP) è un composto chimico sintetico ampiamente utilizzato in varie materie plastiche e polimeri come plastificante per migliorarne la plasticità e la resistenza. Negli ultimi anni, un numero crescente di studi ha suggerito che il DEHP è un interferente endocrino e ha effetti negativi sui sistemi respiratorio, nervoso e riproduttivo dell’uomo e di altri animali 1,2,3. Considerando il suo rischio per la salute, l’Agenzia per la protezione ambientale degli Stati Uniti, l’Unione europea e il Centro di monitoraggio ambientale della Cina hanno tutti classificato il DEHP nell’elenco degli inquinanti prioritari. Il suolo è stato considerato un importante pozzo di DEHP nell’ambiente, a causa dell’applicazione di pacciamatura plastica e fertilizzanti organici, irrigazione con acque reflue e applicazione di fanghi agricoli4. Come previsto, il DEHP è stato rilevato ovunque nei terreni agricoli, il cui contenuto raggiunge anche i milligrammi per chilogrammo di terreno essiccato in alcune regioni della Cina 5,6. Il DEHP può penetrare nelle piante principalmente attraverso le radici e subire biomagnificazione a diversi livelli trofici negli ecosistemi del suolo7. Pertanto, negli ultimi decenni è stata sollevata una notevole preoccupazione per lo stress indotto dal DEHP nelle piante.
Le piante sono solitamente vulnerabili all’esposizione al DEHP. È stato osservato che lo stress del DEHP esercita un effetto negativo sulla germinazione dei semi e sul normale metabolismo, inibendo così la crescita e lo sviluppo delle piante 8,9. Ad esempio, il DEHP può indurre danni ossidativi alle cellule mesofille, diminuire il contenuto di clorofilla e osmoliti ed elevare le attività degli enzimi antiossidanti, con conseguente declino della resa e della qualità delle piante commestibili10,11. Tuttavia, la maggior parte degli studi precedenti sulla risposta delle piante allo stress DEHP si sono concentrati sullo stress ossidativo e sulle caratteristiche fisiologiche e biochimiche. I meccanismi corrispondenti associati al metabolismo delle piante sono meno studiati. Gli essudati radicali sono un termine generico che descrive i composti che le radici delle piante secernono e rilasciano nell’ambiente. Sono stati considerati come il mezzo di interazione tra le piante e il suolo della rizosfera, svolgendo un ruolo importante nel sostenere la crescita e lo sviluppo delle piante12. È noto che gli essudati radicali rappresentano circa il 30% -40% di tutto il carbonio fotosintetico13. In ambienti inquinati, gli essudati radicali sono coinvolti nel miglioramento della tolleranza delle piante allo stress degli inquinanti attraverso il metabolismo o l’esclusione esterna14. Di conseguenza, una profonda comprensione della risposta degli essudati delle radici delle piante allo stress da inquinamento può aiutare a rivelare i meccanismi sottostanti associati alla biochimica cellulare e ai fenomeni biologici15.
La tecnologia metabolomica fornisce una strategia efficiente per misurare un gran numero di metaboliti di piccole molecole contemporaneamente all’interno delle cellule 16,17, dei tessuti18 e persino degli essudati degli organismi 19, inclusi zuccheri, acidi organici, amminoacidi e lipidi. Rispetto ai metodi di analisi chimica tradizionali o classici, l’approccio metabolomico aumenta notevolmente il numero di metaboliti che possono essere rilevati20, il che può aiutare a identificare i metaboliti in modo più elevato e identificare le vie metaboliche chiave. La metabolomica è stata ampiamente utilizzata nel campo di ricerca della risposta biologica in ambienti stressati, come metalli pesanti21, inquinanti emergenti22 e nanoparticelle19. La maggior parte di questi studi sulle piante si sono concentrati sui cambiamenti metabolici nei tessuti vegetali interni, mentre pochi sono stati riportati sulla risposta degli essudati radicali allo stress ambientale. Pertanto, lo scopo di questo studio è quello di introdurre linee guida generali per la raccolta di essudati di radice di erba medica per studiare l’impatto del DEHP sulla produzione di metaboliti. I risultati forniranno una guida metodologica per lo studio di follow-up della metabolomica vegetale da parte del DEHP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo fornisce indicazioni generali su come raccogliere e misurare gli essudati radicali dell’erba medica sotto stress DEHP, nonché su come analizzare i dati del metaboloma. È necessario prestare molta attenzione ad alcuni passaggi critici di questo protocollo. Negli esperimenti di coltura idroponica, le piantine di erba medica sono state coltivate idroponicamente in bottiglie di vetro riempite con soluzioni nutritive con diverse concentrazioni di DEHP. Le bottiglie di vetro devono essere protette dalla luc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto congiuntamente dalla National Natural Science Foundation of China (41877139), dai principali progetti della National Natural Science Foundation of China (41991335), dal National Key Research and Development Program of China (2016YFD0800204), dalla Natural Science Foundation della provincia di Jiangsu (n. BK20161616), dal Piano “135” e dal Programma di frontiera dell’Accademia cinese delle scienze (ISSASIP1615).
Materials
| Adonitol | SIGMA | ≥99% | |
| Alfalfa seeds | Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (Nanjing, China) | ||
| Analytical balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| BSTFA | REGIS Technologies | with 1% TMCS, v/v | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Chromatographic column | Agilent | DB-5MS (30 m × 250 μm × 0.25 μm) | |
| Di(2-ethylhexyl) phthalate | Dr. Ehrenstorfer | ||
| FAMEs | Dr. Ehrenstorfer | ||
| Gas chromatography(GC) | Agilent | 7890A | |
| Grinding instrument | Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd | JXFSTPRP-24 | |
| Mass spectrometer(MS) | LECO | PEGASUS HT | |
| Methanol | CNW Technologies | HPLC | |
| Methoxyaminatio hydrochloride | TCI | AR | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf | Eppendorf Quality | 1.5 mL |
| Oven | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd | DHG-9023A | |
| Pyridine | Adamas | HPLC | |
| R software | statistical analysis software (pathway enrichment, topology) | ||
| SIMCA16.0.2 | statistical analysis software (OPLS-DA etc) | ||
| Ultra low temperature freezer | Thermo Fisher Scientific | Forma 900 series | |
| Ultrasound | Shenzhen Fangao Microelectronics Co., Ltd | YM-080S | |
| Vacuum dryer | Taicang Huamei biochemical instrument factory | LNG-T98 |
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