אופטימיזציה של פרמטרים למיון ציטומטרי של זרימה לבידוד וטיהור של בועיות חוץ-תאיות קטנות בתפוקה גבוהה
Summary
פרוטוקול זה מספק שיטת בידוד מהירה וספציפית לגודל עבור בועיות חוץ-תאיות קטנות על ידי מיטוב גודל פיית ריסוס האוויר, לחץ נוזל הנדן, לחץ זרימת הדגימה, מתח, רווח ופרמטרי סף הפעלה.
Abstract
שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (sEV) יכולות להשתחרר מכל סוגי התאים ולשאת חלבון, דנ”א ורנ”א. מולקולות איתות משמשות אינדיקטורים למצב הפיזיולוגי והפתולוגי של התא. עם זאת, אין שיטה סטנדרטית לבידוד sEV, המונעת זיהוי סמנים ביולוגיים במורד הזרם ומחקרי התערבות תרופתית. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיהור של 50-200 ננומטר sEV על ידי ממיין תאי זרימה. לשם כך, נבחרו זרבובית 50 מיקרומטר ולחץ נוזל נדן 80 psi כדי להשיג קצב מיון טוב וזרם צד יציב. מיקרוספרות פוליסטירן בגודל סטנדרטי שימשו לאיתור אוכלוסיות של חלקיקי 100, 200 ו-300 ננומטר. עם מיטוב נוסף של סף הפעלת המתח, הרווח והפיזור הקדמי (FSC), ניתן להפריד את אות ה- sEV מרעשי הרקע. אופטימיזציות אלה מספקות פאנל של הגדרות מיון קריטיות המאפשר לקבל אוכלוסייה מייצגת של sEV באמצעות FSC לעומת פיזור צד (SSC) בלבד. שיטת הבידוד מבוססת ציטומטריית זרימה לא רק מאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה, אלא גם מאפשרת סיווג סינכרוני או ניתוח פרוטאום של sEV בהתבסס על ביטוי הסמן הביולוגי, ופותחת יישומי מחקר רבים במורד הזרם.
Introduction
תא משחרר שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) בגדלים שונים שגורמות למולקולות איתות ותכלילי ממברנה, החשובים לתקשורת בין-תאית1. כלי רכב חשמליים בגדלים שונים ממלאים גם תפקידים ביולוגיים שונים, כאשר 50-200 ננומטר sEV מסוגלים להפיץ במדויק רנ”א, דנ”א וחלבונים למיקום החוץ תאי הנכון. ה- sEV מסייע גם לקבוע את מנגנוני ההפרשה שלהם, הכוללים לא רק את הרגולציה של תהליכים פיזיולוגיים נורמליים כגון מעקב חיסוני, תחזוקת תאי גזע, קרישת דם ותיקון רקמות, אלא גם את הפתולוגיה העומדת בבסיס מספר מחלות כגון התקדמות הגידול וגרורות 2,3. בידוד וניתוח יעילים של sEV הם קריטיים לזיהוי סמנים ביולוגיים ולתכנון התערבויות עתידיות בתרופות.
עם מחקר מתמשך על היישום הקליני של sEV, שיטות הבידוד של sEV הציבו דרישות גבוהות יותר. בשל ההטרוגניות של sEV בגודל, במקור ובתוכן, כמו גם הדמיון שלהם עם כלי רכב חשמליים אחרים בתכונות פיסיקוכימיות וביוכימיות, אין שיטה סטנדרטית לבידוד sEV 4,5. נכון לעכשיו, אולטרה-צנטריפוגה, כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC), משקעים פולימריים ולכידת זיקה חיסונית הן שיטות בידוד sEV הנפוצות ביותר6. אולטרה-צנטריפוגה היא עדיין תקן הזהב לבידוד sEV במחקר, למרות היותה גוזלת זמן, וכתוצאה מכך טוהר נמוך עם פיזור גודל רחב של 40-500 ננומטר ונזק מכני משמעותי לרכב החשמלי לאחר צנטריפוגה ארוכת טווח 7,8,9. משקעים פולימריים, אשר בדרך כלל משתמש פוליאתילן גליקול (PEG), סובל טוהר בלתי מתקבל על הדעת עבור ניתוח פונקציונלי לאחר מכן עם משקעים במקביל של אגרגטים חלבונים תאיים וזיהום פולימר10,11. שיטות מבוססות לכידת זיקה חיסונית דורשות נוגדנים בעלות גבוהה עם ספציפיות משתנה, כמו גם יש בעיות עם נפח עיבוד נמוך ותשואות12,13,14. גודל החלקיקים הוא אחד המדדים העיקריים להערכת הטוהר של sEV מבודד. למרות שטוהר sEV נותר יעד בלתי ניתן להשגה, SEC מסיר כמות ניכרת של רכיבים בינוניים, וחלקיקי sEV המופקים בשיטת SEC הם בעיקר בטווח של 50-200 ננומטר15. לטכניקות הקיימות יש כמה חסרונות, כולל אך לא מוגבל להיותן גוזלות זמן, טוהר נמוך, תפוקה נמוכה, יכולת שחזור ירודה, תפוקה נמוכה של דגימות ונזק פוטנציאלי של sEV, מה שהופך אותן ללא תואמות לניצול קליני16. לפיכך, שיטת בידוד sEV מהירה, זולה ומוגדרת בגודל המתאים לנוזלים ביולוגיים מגוונים היא צורך חיוני במספר מצבים מחקריים וקליניים.
בציטומטריית זרימה, חלקיקים בודדים מנותחים באופן רב-פרמטרי בתפוקה גבוהה, ותת-קבוצות ממוינות17. בשל ההטרוגניות של כלי רכב חשמליים, מדידה ציטומטרית של זרימה של חלקיק יחיד תהיה אידיאלית, אשר שימשה לחקר כלי רכב חשמליים בעקבות הפרדיגמות של ניתוח תאים, עם תוויות פיזור אור ופלואורסצנטיות המשמשות לזיהוי תכונות הקשורות לפיזיולוגיה ורכיבי חלבון18,19,20. עם זאת, ציטומטריית זרימה קונבנציונלית מאותגרת על ידי הגודל הקטן של sEV והשפע הנמוך של סמנים ביולוגיים על פני השטח. ניתן לשפר את הרגישות של ציטומטריית זרימה על ידי אופטימיזציה של פרמטרי זיהוי כדי להבחין בין רעשי רקע ו- sEV ללא קשר לשימוש בפיזור קדמי (FSC), פיזור צד (SSC) או פרמטר מפעיל סף פלואורסצנטי19.
עם הפרוטוקול הנוכחי, הגדרות מיון ציטומטריות זרימה ברזולוציה גבוהה עברו אופטימיזציה באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים כסטנדרט. על ידי בחירת גודל הזרבובית המתאים, לחץ נוזל הנדן, פרמטר הפעלת הסף והמתחים השולטים בעוצמות האור המפוזרות, הצלחנו לבודד תת-קבוצה ספציפית של sEV מתערובת מורכבת.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר שיטה אופטימלית לבידוד וטיהור sEV עם גודל החלקיקים שצוין של 50-200 ננומטר באמצעות ממיין תאי זרימה, שאומת על ידי נת”ע. השיטה פתרה את בעיית צוואר הבקבוק של קבלת sEV עם גודל חלקיקים אחיד וטוהר גבוה, תוך הימנעות מהפרעות של מולקולות ביולוגיות לא קשורות עטופות ברכבים חשמליים גדולים<sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר המדעי של אוניברסיטת ג’ג’יאנג לרפואה סינית (2020ZG29), פרויקט מחקר הרווחה הציבורית הבסיסית של מחוז ג’ג’יאנג (LGF19H150006, LTGY23B070001), הפרויקט של מחלקת החינוך של מחוז ג’ג’יאנג (Y202147028) ופרויקט הטכנולוגיה הניסויית של מחלקת המעבדות של אוניברסיטת ג’ג’יאנג (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
