Optimalisatie van flowcytometrische sorteerparameters voor isolatie met hoge doorvoer en zuivering van kleine extracellulaire blaasjes
Summary
Dit protocol biedt een snelle en groottespecifieke isolatiemethode voor kleine extracellulaire blaasjes door de grootte van de luchtsproeikop te optimaliseren, de druk van de mantelvloeistof, de druk van de monsterstroom, de spanning, versterking en triggerdrempelparameters.
Abstract
Kleine extracellulaire blaasjes (sEV) kunnen worden vrijgegeven uit alle celtypen en dragen eiwit, DNA en RNA. Signaalmoleculen dienen als indicatoren van de fysiologische en pathologische toestand van een cel. Er is echter geen standaardmethode voor sEV-isolatie, die downstream biomarkeridentificatie en geneesmiddelinterventiestudies voorkomt. In dit artikel geven we een gedetailleerd protocol voor de isolatie en zuivering van 50-200 nm sEV door een flowcelsorteerder. Hiervoor werd gekozen voor een mondstuk van 50 μm en een mantelvloeistofdruk van 80 psi om een goede sorteersnelheid en een stabiele zijstroom te verkrijgen. Polystyreenmicrosferen van standaardformaat werden gebruikt om populaties van deeltjes van 100, 200 en 300 nm te lokaliseren. Met extra optimalisatie van de spannings-, versterkings- en forward scatter (FSC) triggering threshold, kon het sEV-signaal worden gescheiden van de achtergrondruis. Deze optimalisaties bieden een paneel met kritieke sorteerinstellingen waarmee men een representatieve populatie van sEV kan verkrijgen met alleen FSC versus side scatter (SSC). De op flowcytometrie gebaseerde isolatiemethode maakt niet alleen analyse met hoge doorvoer mogelijk, maar maakt ook synchrone classificatie of proteoomanalyse van sEV mogelijk op basis van de biomarkerexpressie, waardoor tal van downstream-onderzoekstoepassingen worden geopend.
Introduction
Een cel geeft extracellulaire blaasjes (EV’s) van verschillende groottes af die resulteren in signaalmoleculen en membraaninsluitsels, die belangrijk zijn voor intercellulaire communicatie1. EV’s van verschillende groottes spelen ook verschillende biologische rollen, waarbij 50-200 nm sEV in staat is om RNA, DNA en eiwitten nauwkeurig te verdelen naar de juiste extracellulaire locatie. De sEV helpt ook bij het bepalen van hun secretiemechanismen, waarbij niet alleen de regulatie van normale fysiologische processen zoals immuunsurveillance, stamcelonderhoud, bloedstolling en weefselherstel betrokken is, maar ook de pathologie die ten grondslag ligt aan verschillende ziekten zoals tumorprogressie en metastase 2,3. Effectieve isolatie en analyse van sEV zijn van cruciaal belang voor het identificeren van biomarkers en het ontwerpen van toekomstige medicijninterventies.
Met continu onderzoek naar de klinische toepassing van sEV hebben de isolatiemethoden van sEV hogere eisen gesteld. Vanwege de heterogeniteit van sEV in grootte, bron en inhoud, evenals hun gelijkenis met andere EV’s in fysisch-chemische en biochemische eigenschappen, is er geen standaardmethode voor sEV-isolatie 4,5. Momenteel zijn ultracentrifugatie, grootte-uitsluitingschromatografie (SEC), polymeerprecipitatie en immunoaffiniteitsafvang de meest voorkomende sEV-isolatiemethoden6. Ultracentrifugatie is nog steeds de gouden standaard voor sEV-isolatie in onderzoek, ondanks dat het tijdrovend is, wat resulteert in een lage zuiverheid met een brede grootteverdeling van 40-500 nm en aanzienlijke mechanische schade aan de sEV na langdurige centrifugatie 7,8,9. Polymeerprecipitatie, waarbij meestal polyethyleenglycol (PEG) wordt gebruikt, lijdt aan onaanvaardbare zuiverheid voor latere functionele analyse met gelijktijdige precipitatie van extracellulaire eiwitaggregaten en polymeerverontreiniging10,11. Op immunoaffiniteitsvangst gebaseerde methoden vereisen dure antilichamen met verschillende specificiteit, evenals problemen met een laag verwerkingsvolume en opbrengstenvan 12,13,14. Deeltjesgrootte is een van de belangrijkste indicatoren om de zuiverheid van geïsoleerde sEV te evalueren. Hoewel sEV-zuiverheid een onbereikbaar doel blijft, verwijdert SEC een aanzienlijke hoeveelheid mediumcomponenten en liggen de sEV-deeltjes die met de SEC-methode worden geëxtraheerd voornamelijk in het bereik van 50-200 nm15. De bestaande technieken hebben een paar nadelen, waaronder maar niet beperkt tot tijdrovend, lage zuiverheid, lage opbrengst, slechte reproduceerbaarheid, lage doorvoer van monsters en potentiële schade aan sEV, waardoor het onverenigbaar is met klinisch gebruik16. Een snelle, goedkope en op maat gespecificeerde sEV-isolatiemethode die van toepassing is op diverse biovloeistoffen is dus een essentiële behoefte in verschillende onderzoeks- en klinische situaties.
In flowcytometrie worden afzonderlijke deeltjes geanalyseerd op een multiparametrische manier met hoge doorvoer en worden subsets gesorteerd17. Vanwege de heterogeniteit van EV’s zou een cytometrische meting van één deeltjesstroom ideaal zijn, die is gebruikt om EV’s te onderzoeken volgens de paradigma’s van celanalyse, waarbij lichtverstrooiings- en fluorescentielabels worden gebruikt om fysiologiegerelateerde kenmerken en eiwitcomponenten te identificeren18,19,20. Niettemin wordt conventionele flowcytometrie uitgedaagd door de kleine omvang van sEV en de lage abundantie van oppervlaktebiomarkers. De gevoeligheid van flowcytometrie kan worden verbeterd door detectieparameters te optimaliseren om achtergrondgeluid en sEV te onderscheiden, ongeacht het gebruik van forward scatter (FSC), side scatter (SSC) of fluorescentiedrempel triggering parameter19.
Met het huidige protocol werden hoge resolutie flowcytometrische sorteerinstellingen geoptimaliseerd met standaard fluorescerende kralen. Door de juiste spuitmondgrootte, de druk van de mantelvloeistof, de drempeltriggerparameter en spanningen te selecteren die de intensiteit van het verstrooide licht regelen, konden we een specifieke subset van sEV isoleren van een complex mengsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol schetst een geoptimaliseerde methode om sEV te isoleren en te zuiveren met de gespecificeerde deeltjesgrootte van 50-200 nm met behulp van een flowcelsorteerder, die werd gevalideerd door NTA. De methode loste het knelpuntprobleem op van het verkrijgen van sEV met uniforme deeltjesgrootte en hoge zuiverheid, waarbij interferentie van niet-gerelateerde biologische moleculen verpakt in grote EV’swerd vermeden 22. Snelle, high-throughput analyses zijn mogelijk met flowcytometrie, die 100…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Scientific Research Fund van Zhejiang Chinese Medicine University (2020ZG29), het Basic Public Welfare Research Project van de provincie Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), het Project van Zhejiang Provincial Department of Education (Y202147028) en het Project of Experimental Technology van Zhejiang University Laboratory Department (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
