Оптимизация параметров проточной цитометрической сортировки для высокопроизводительной изоляции и очистки малых внеклеточных везикул

Клетка высвобождает внеклеточные везикулы (ВВ) различных размеров, что приводит к появлению сигнальных молекул и мембранных включений, которые важны для межклеточной коммуникации¹. EV разных размеров также играют разные биологические роли: 50-200 нм sEV способны точно распределять РНК, ДНК и белки в правильном внеклеточном месте. sEV также помогает определить механизмы секреции, включающие не только регуляцию нормальных физиологических процессов, таких как иммунный надзор, поддержание стволовых клеток, свертывание крови и восстановление тканей, но и патологию, лежащую в основе нескольких заболеваний, таких как прогрессирование опухоли и метастазирование ^2,3. Эффективная изоляция и анализ sEV имеют решающее значение для выявления биомаркеров и разработки будущих лекарственных вмешательств.

Благодаря непрерывным исследованиям клинического применения sEV методы выделения sEV выдвинули более высокие требования. Из-за неоднородности sEV по размеру, источнику и содержанию, а также их сходства с другими EV по физико-химическим и биохимическим свойствам не существует стандартного метода выделения sEV ^4,5. В настоящее время ультрацентрифугирование, эксклюзионная хроматография (SEC), осаждение полимеров и иммуноаффинный захват являются наиболее распространенными методами выделения sEV⁶. Ультрацентрифугирование по-прежнему является золотым стандартом выделения sEV в исследованиях, несмотря на то, что оно отнимает много времени, что приводит к низкой чистоте с широким распределением по размерам 40-500 нм и значительным механическим повреждениям sEV после длительного центрифугирования ^7,8,9. Осаждение полимеров, в котором обычно используется полиэтиленгликоль (ПЭГ), страдает от неприемлемой чистоты для последующего функционального анализа с сопутствующим осаждением внеклеточных белковых агрегатов и полимерной контаминацией^10,11. Методы, основанные на иммуноаффинном захвате, требуют дорогостоящих антител с различной специфичностью, а также имеют проблемы с низким объемом обработки и выходами^12,13,14. Размер частиц является одним из основных показателей для оценки чистоты изолированного sEV. Хотя чистота sEV остается недостижимой целью, SEC удаляет большое количество компонентов среды, а частицы sEV, извлеченные методом SEC, в основном находятся в диапазоне 50-200 нм¹⁵. Существующие методы имеют несколько недостатков, включая, помимо прочего, трудоемкость, низкую чистоту, низкий выход продукции, плохую воспроизводимость, низкую пропускную способность образцов и потенциальное повреждение sEV, что делает его несовместимым с клиническим использованием¹⁶. Таким образом, быстрый, недорогой и специфический по размеру метод выделения sEV, применимый к различным биожидкостям, является насущной необходимостью в нескольких исследовательских и клинических ситуациях.

При проточной цитометрии отдельные частицы анализируются высокопроизводительным, многопараметрическим способом, а подмножества сортируются¹⁷. Из-за гетерогенности ЭВ идеальным было бы цитометрическое измерение потока одной частицы, которое использовалось для исследования ВВ в соответствии с парадигмами клеточного анализа, при этом светорассеяние и флуоресцентные метки использовались для идентификации связанных с физиологией особенностей и белковых компонентов^18,19,20. Тем не менее, традиционная проточная цитометрия сталкивается с трудностями из-за небольшого размера sEV и низкого содержания поверхностных биомаркеров. Чувствительность проточной цитометрии может быть улучшена за счет оптимизации параметров детектирования для различения фонового шума и sEV независимо от использования прямого рассеяния (FSC), бокового рассеяния (SSC) или порога срабатывания порога флуоресценции¹⁹.

В соответствии с настоящим протоколом настройки проточной цитометрической сортировки с высоким разрешением были оптимизированы с использованием флуоресцентных шариков в стандартной комплектации. Выбрав правильный размер сопла, давление жидкости в оболочке, пороговый параметр срабатывания и напряжения, контролирующие интенсивность рассеянного света, мы смогли выделить определенное подмножество sEV из сложной смеси.