Otimização dos Parâmetros de Classificação por Citometria de Fluxo para Isolamento de Alto Rendimento e Purificação de Pequenas Vesículas Extracelulares
Summary
Este protocolo fornece um método de isolamento rápido e específico para pequenas vesículas extracelulares, otimizando o tamanho do bico de pulverização de ar, a pressão do fluido da bainha, a pressão do fluxo da amostra, a tensão, o ganho e os parâmetros do limiar de disparo.
Abstract
Pequenas vesículas extracelulares (sEV) podem ser liberadas de todos os tipos celulares e transportar proteínas, DNA e RNA. As moléculas sinalizadoras servem como indicadores do estado fisiológico e patológico de uma célula. No entanto, não há um método padrão para o isolamento de sEV, o que impede a identificação de biomarcadores a jusante e estudos de intervenção medicamentosa. Neste artigo, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento e purificação de sEV de 50-200 nm por um classificador de células de fluxo. Para isso, um bocal de 50 μm e uma pressão de fluido de bainha de 80 psi foram selecionados para obter uma boa taxa de classificação e fluxo lateral estável. Microesferas de poliestireno de tamanho padrão foram usadas para localizar populações de partículas de 100, 200 e 300 nm. Com a otimização adicional do limiar de disparo de tensão, ganho e dispersão direta (FSC), o sinal sEV pode ser separado do ruído de fundo. Essas otimizações fornecem um painel de configurações de classificação crítica que permite obter uma população representativa de sEV usando FSC vs. dispersão lateral (SSC) somente. O método de isolamento baseado em citometria de fluxo não só permite a análise de alto rendimento, mas também permite a classificação síncrona ou análise de proteoma de sEV com base na expressão de biomarcadores, abrindo inúmeras aplicações de pesquisa a jusante.
Introduction
Uma célula libera vesículas extracelulares (EVs) de tamanhos variados que resultam em moléculas sinalizadoras e inclusões de membrana, que são importantes para a comunicação intercelular1. EVs de diferentes tamanhos também desempenham diferentes papéis biológicos, com 50-200 nm sEV sendo capaz de distribuir precisamente RNA, DNA e proteínas para o local extracelular correto. A EV também ajuda a determinar seus mecanismos de secreção, envolvendo não apenas a regulação de processos fisiológicos normais, como vigilância imunológica, manutenção de células-tronco, coagulação sanguínea e reparo tecidual, mas também a patologia subjacente a várias doenças, como progressão tumoral e metástase2,3. O isolamento e a análise eficazes de sEV são críticos para identificar biomarcadores e projetar futuras intervenções medicamentosas.
Com pesquisas contínuas sobre a aplicação clínica de sEV, os métodos de isolamento de sEV apresentaram requisitos mais elevados. Devido à heterogeneidade dos EVs em tamanho, fonte e conteúdo, bem como sua semelhança com outros EVs em propriedades físico-químicas e bioquímicas, não existe um método padrão para o isolamento de EVs 4,5. Atualmente, ultracentrifugação, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), precipitação de polímero e captura de imunoafinidade são os métodos mais comuns de isolamento de sEV6. A ultracentrifugação ainda é o padrão ouro para o isolamento de sEV em pesquisas, apesar de ser demorada, resultando em baixa pureza com uma ampla distribuição de tamanho de 40-500 nm e danos mecânicos significativos ao sEV após centrifugação de longa duração 7,8,9. A precipitação polimérica, que geralmente utiliza polietilenoglicol (PEG), sofre de pureza inaceitável para posterior análise funcional com precipitação concomitante de agregados proteicos extracelulares e contaminação do polímero10,11. Métodos baseados em captura de imunoafinidade requerem anticorpos de alto custo com especificidade variável, além de apresentarem problemas com baixo volume de processamento e rendimento12,13,14. O tamanho das partículas é um dos principais indicadores para avaliar a pureza do sEV isolado. Embora a pureza do sEV continue sendo uma meta inatingível, o SEC remove uma quantidade considerável de componentes médios, e as partículas de sEV extraídas pelo método SEC estão principalmente na faixa de 50-200 nm15. As técnicas existentes apresentam algumas desvantagens, incluindo, mas não se limitando a, serem demoradas, de baixa pureza, baixo rendimento, baixa reprodutibilidade, baixo rendimento das amostras e dano potencial de sEV, o que a torna incompatível com o uso clínico16. Assim, um método de isolamento de sEV rápido, barato e com tamanho especificado aplicável a diversos biofluidos é uma necessidade essencial em várias situações clínicas e de pesquisa.
Na citometria de fluxo, partículas isoladas são analisadas de forma multiparamétrica de alto rendimento e os subconjuntos são separados17. Devido à heterogeneidade dos EVs, seria ideal uma medida por citometria de fluxo de partícula única, que tem sido utilizada para investigar EVs seguindo os paradigmas da análise celular, sendo utilizados marcadores de dispersão de luz e fluorescência para identificar características relacionadas à fisiologia e componentes proteicos18,19,20. No entanto, a citometria de fluxo convencional é desafiada pelo pequeno tamanho do sEV e baixa abundância de biomarcadores de superfície. A sensibilidade da citometria de fluxo pode ser melhorada otimizando-se os parâmetros de detecção para distinguir ruído de fundo e sEV, independentemente do uso do parâmetro de dispersão direta (FSC), dispersão lateral (SSC) ou limiar de fluorescência19.
Com o presente protocolo, os ajustes de classificação por citometria de fluxo de alta resolução foram otimizados usando esferas fluorescentes como padrão. Ao selecionar o tamanho adequado do bico, a pressão do fluido da bainha, o parâmetro de disparo do limiar e as tensões que controlam as intensidades de luz espalhada, conseguimos isolar um subconjunto específico de sEV de uma mistura complexa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método otimizado para isolar e purificar sEV com o tamanho de partícula especificado de 50-200 nm usando um classificador de células de fluxo, que foi validado por NTA. O método resolveu o problema do gargalo de obtenção de sEV com granulometria uniforme e alta pureza, evitando a interferência de moléculas biológicas não relacionadas envoltas em EVs de grande porte22. Análises rápidas e de alto rendimento são possíveis com a citometria de fluxo, que pode ca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Pesquisa Científica da Universidade de Medicina Chinesa de Zhejiang (2020ZG29), pelo Projeto de Pesquisa de Bem-Estar Público Básico da Província de Zhejiang (LGF19H150006, LTGY23B070001), pelo Projeto do Departamento de Educação da Província de Zhejiang (Y202147028) e pelo Projeto de Tecnologia Experimental do Departamento de Laboratório da Universidade de Zhejiang (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
