تحسين معلمات الفرز الخلوي للتدفق لعزل وتنقية الحويصلات الصغيرة خارج الخلية
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة عزل سريعة ومحددة الحجم للحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق تحسين حجم فوهة رش الهواء وضغط سائل الغمد وضغط تدفق العينة والجهد والكسب ومعلمات عتبة التشغيل.
Abstract
يمكن إطلاق الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEV) من جميع أنواع الخلايا وتحمل البروتين والحمض النووي والحمض النووي الريبي. تعمل جزيئات الإشارة كمؤشرات للحالة الفسيولوجية والمرضية للخلية. ومع ذلك ، لا توجد طريقة قياسية لعزل sEV ، مما يمنع تحديد العلامات الحيوية النهائية ودراسات التدخل الدوائي. في هذه المقالة ، نقدم بروتوكولا مفصلا لعزل وتنقية 50-200 نانومتر sEV بواسطة فارز خلايا التدفق. لهذا الغرض ، تم اختيار فوهة 50 ميكرومتر وضغط سائل غمد 80 رطل لكل بوصة مربعة للحصول على معدل فرز جيد وتيار جانبي مستقر. تم استخدام الكريات المجهرية للبوليسترين ذات الحجم القياسي لتحديد مجموعات من الجسيمات 100 و 200 و 300 نانومتر. مع التحسين الإضافي لعتبة تشغيل الجهد والكسب والتشتت الأمامي (FSC) ، يمكن فصل إشارة sEV عن ضوضاء الخلفية. توفر هذه التحسينات لوحة من إعدادات الفرز الحرجة التي تمكن المرء من الحصول على مجموعة تمثيلية من sEV باستخدام FSC مقابل التشتت الجانبي (SSC) فقط. لا تسمح طريقة العزل القائمة على قياس التدفق الخلوي بتحليل الإنتاجية العالية فحسب ، بل تسمح أيضا بالتصنيف المتزامن أو تحليل البروتين ل sEV بناء على تعبير العلامات الحيوية ، مما يفتح العديد من تطبيقات البحث النهائية.
Introduction
تطلق الخلية حويصلات خارج الخلية (EVs) بأحجام مختلفة تؤدي إلى جزيئات إشارات وشوائب غشائية ، وهي مهمة للتواصل بين الخلايا1. تلعب المركبات الكهربائية ذات الأحجام المختلفة أيضا أدوارا بيولوجية مختلفة ، حيث يمكن ل 50-200 نانومتر sEV توزيع الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتينات بدقة على الموقع الصحيح خارج الخلية. يساعد sEV أيضا في تحديد آليات إفرازها ، والتي لا تتضمن فقط تنظيم العمليات الفسيولوجية الطبيعية مثل المراقبة المناعية ، وصيانة الخلايا الجذعية ، وتخثر الدم ، وإصلاح الأنسجة ولكن أيضا علم الأمراض الكامن وراء العديد من الأمراض مثل تطور الورم وورم خبيث 2,3. يعد العزل والتحليل الفعالان للمركبات الكهربائية أمرا بالغ الأهمية لتحديد المؤشرات الحيوية وتصميم التدخلات الدوائية المستقبلية.
مع البحث المستمر حول التطبيق السريري ل sEV ، طرحت طرق عزل sEV متطلبات أعلى. نظرا لعدم تجانس sEV في الحجم والمصدر والمحتويات ، فضلا عن تشابهها مع المركبات الكهربائية الأخرى في الخواص الفيزيائية والكيميائية الحيوية ، لا توجد طريقة قياسية لعزل sEV 4,5. حاليا ، يعد الطرد المركزي الفائق ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، وترسيب البوليمر ، والتقاط التقارب المناعي أكثر طرق عزل sEV شيوعا6. لا يزال الطرد المركزي الفائق هو المعيار الذهبي لعزل sEV في البحث ، على الرغم من كونه يستغرق وقتا طويلا ، مما يؤدي إلى نقاء منخفض مع توزيع واسع الحجم من 40-500 نانومتر وأضرار ميكانيكية كبيرة لل sEV بعد الطرد المركزي طويل المدى7،8،9. يعاني ترسيب البوليمر ، الذي يستخدم عادة البولي إيثيلين جلايكول (PEG) ، من نقاء غير مقبول للتحليل الوظيفي اللاحق مع الترسيب المصاحب لمجاميع البروتين خارج الخلية وتلوث البوليمر10,11. تتطلب الطرق القائمة على التقاط التقارب المناعي أجساما مضادة عالية التكلفة ذات خصوصية متفاوتة ، بالإضافة إلى وجود مشاكل في انخفاض حجم المعالجة وإنتاجية12،13،14. حجم الجسيمات هو أحد المؤشرات الرئيسية لتقييم نقاء sEV المعزول. على الرغم من أن نقاء sEV لا يزال هدفا بعيد المنال ، إلا أن SEC يزيل كمية كبيرة من المكونات المتوسطة ، وجزيئات sEV المستخرجة بواسطة طريقة SEC هي أساسا في حدود 50-200 نانومتر15. التقنيات الحالية لها بعض العيوب ، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر كونها تستغرق وقتا طويلا ، ونقاء منخفض ، وعائد منخفض ، وضعف قابلية التكاثر ، وانخفاض إنتاجية العينات ، والضرر المحتمل ل sEV ، مما يجعلها غير متوافقة مع الاستخدام السريري16. وبالتالي ، فإن طريقة عزل sEV السريعة وغير المكلفة والمحددة الحجم المطبقة على السوائل الحيوية المتنوعة هي حاجة أساسية في العديد من الحالات البحثية والسريرية.
في قياس التدفق الخلوي ، يتم تحليل الجسيمات المفردة بطريقة عالية الإنتاجية ومتعددة المعلمات ، ويتم فرز المجموعات الفرعية17. نظرا لعدم تجانس المركبات الكهربائية ، سيكون القياس الخلوي لتدفق الجسيمات الواحدة مثاليا ، والذي تم استخدامه للتحقيق في المركبات الكهربائية باتباع نماذج تحليل الخلية ، مع استخدام ملصقات تشتت الضوء والتألق لتحديد الميزات المتعلقة بعلم وظائف الأعضاء ومكونات البروتين18،19،20. ومع ذلك ، فإن قياس التدفق الخلوي التقليدي يواجه تحديا بسبب صغر حجم sEV وانخفاض وفرة المؤشرات الحيوية السطحية. يمكن تحسين حساسية قياس التدفق الخلوي من خلال تحسين معلمات الكشف لتمييز ضوضاء الخلفية و sEV بغض النظر عن استخدام التشتت الأمامي (FSC) أو التشتت الجانبي (SSC) أو عتبة التألقالتي تؤدي إلى تشغيل المعلمة 19.
مع البروتوكول الحالي ، تم تحسين إعدادات الفرز الخلوي عالية التدفق باستخدام حبات الفلورسنت كمعيار. من خلال اختيار حجم الفوهة المناسب ، وضغط سائل الغمد ، ومعلمة تشغيل العتبة ، والفولتية التي تتحكم في شدة الضوء المتناثرة ، تمكنا من عزل مجموعة فرعية محددة من sEV من خليط معقد.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحدد هذا البروتوكول طريقة محسنة لعزل وتنقية sEV بحجم الجسيمات المحدد من 50-200 نانومتر باستخدام فارز خلايا التدفق ، والذي تم التحقق من صحته بواسطة NTA. حلت الطريقة مشكلة عنق الزجاجة المتمثلة في الحصول على sEV بحجم جسيم موحد ونقاء عالي ، وتجنب التداخل من الجزيئات البيولوجية غير ذات الصلة الملفوفة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل صندوق البحث العلمي بجامعة تشجيانغ للطب الصيني (2020ZG29) ، ومشروع أبحاث الرفاهية العامة الأساسية لمقاطعة تشجيانغ (LGF19H150006 ، LTGY23B070001) ، ومشروع وزارة التعليم بمقاطعة تشجيانغ (Y202147028) ومشروع التكنولوجيا التجريبية لقسم مختبر جامعة تشجيانغ (SJS201712 ، SYB202130).
Materials
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
References
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
