Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Una cellula rilascia vescicole extracellulari (EV) di varie dimensioni che si traducono in molecole di segnalazione e inclusioni di membrana, che sono importanti per la comunicazione intercellulare¹. Anche le EV di diverse dimensioni svolgono ruoli biologici diversi, con 50-200 nm sEV in grado di distribuire con precisione RNA, DNA e proteine nella corretta posizione extracellulare. Il sEV aiuta anche a determinare i loro meccanismi di secrezione, coinvolgendo non solo la regolazione dei normali processi fisiologici come la sorveglianza immunitaria, il mantenimento delle cellule staminali, la coagulazione del sangue e la riparazione dei tessuti, ma anche la patologia alla base di diverse malattie come la progressione del tumore e le metastasi ^2,3. Un isolamento e un’analisi efficaci della sEV sono fondamentali per identificare i biomarcatori e progettare futuri interventi farmacologici.

Con la continua ricerca sull’applicazione clinica di sEV, i metodi di isolamento di sEV hanno avanzato requisiti più elevati. A causa dell’eterogeneità di sEV in termini di dimensioni, fonte e contenuto, nonché della loro somiglianza con altri EV nelle proprietà fisico-chimiche e biochimiche, non esiste un metodo standard per l’isolamento di sEV ^4,5. Attualmente, l’ultracentrifugazione, la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), la precipitazione polimerica e la cattura per immunoaffinità sono i metodi di isolamento sEV più comuni⁶. L’ultracentrifugazione è ancora il gold standard per l’isolamento di sEV nella ricerca, nonostante richieda molto tempo, con conseguente bassa purezza con un’ampia distribuzione dimensionale di 40-500 nm e danni meccanici significativi al sEV dopo centrifugazione a lungo termine ^7,8,9. La precipitazione polimerica, che di solito utilizza glicole polietilenico (PEG), soffre di purezza inaccettabile per la successiva analisi funzionale con concomitante precipitazione di aggregati proteici extracellulari e contaminazione polimerica^10,11. I metodi basati sulla cattura dell’immunoaffinità richiedono anticorpi ad alto costo con specificità variabile, oltre ad avere problemi con bassi volumi di elaborazione e rese^12,13,14. La dimensione delle particelle è uno dei principali indicatori per valutare la purezza del sEV isolato. Sebbene la purezza di sEV rimanga un obiettivo irraggiungibile, SEC rimuove una notevole quantità di componenti medi e le particelle sEV estratte con il metodo SEC sono principalmente nell’intervallo 50-200 nm¹⁵. Le tecniche esistenti presentano alcuni svantaggi, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la lunga durata, la bassa purezza, la bassa resa, la scarsa riproducibilità, la bassa produttività dei campioni e il potenziale danno della sEV, che la rende incompatibile con l’utilizzo clinico¹⁶. Pertanto, un metodo di isolamento sEV rapido, economico e dimensionale applicabile a diversi biofluidi è una necessità essenziale in diverse situazioni di ricerca e cliniche.

Nella citometria a flusso, le singole particelle vengono analizzate in modo multiparametrico ad alto rendimento e i sottoinsiemi vengono selezionati¹⁷. A causa dell’eterogeneità delle EV, sarebbe ideale una misurazione citometrica a flusso di particelle singole, che è stata utilizzata per studiare le EV seguendo i paradigmi dell’analisi cellulare, con etichette di dispersione della luce e fluorescenza utilizzate per identificare le caratteristiche correlate alla fisiologia e i componenti proteici^18,19,20. Tuttavia, la citometria a flusso convenzionale è messa alla prova dalle piccole dimensioni di sEV e dalla bassa abbondanza di biomarcatori di superficie. La sensibilità della citometria a flusso potrebbe essere migliorata ottimizzando i parametri di rilevamento per distinguere il rumore di fondo e il sEV indipendentemente dall’utilizzo di scatter in avanti (FSC), dispersione laterale (SSC) o parametro di attivazione della soglia di fluorescenza¹⁹.

Con il presente protocollo, le impostazioni di ordinamento citometrico a flusso ad alta risoluzione sono state ottimizzate utilizzando sfere fluorescenti come standard. Selezionando la dimensione corretta dell’ugello, la pressione del fluido della guaina, il parametro di attivazione della soglia e le tensioni che controllano le intensità della luce diffusa, siamo stati in grado di isolare un sottoinsieme specifico di sEV da una miscela complessa.