Optimisation des paramètres de tri cytométrique en flux pour l’isolation et la purification à haut débit de petites vésicules extracellulaires

Une cellule libère des vésicules extracellulaires (VE) de différentes tailles qui entraînent des molécules de signalisation et des inclusions membranaires, ce qui est important pour la communication intercellulaire¹. Les VE de différentes tailles jouent également différents rôles biologiques, avec 50-200 nm sEV pouvant distribuer avec précision l’ARN, l’ADN et les protéines au bon emplacement extracellulaire. Le sEV aide également à déterminer leurs mécanismes de sécrétion, impliquant non seulement la régulation des processus physiologiques normaux tels que la surveillance immunitaire, le maintien des cellules souches, la coagulation sanguine et la réparation des tissus, mais aussi la pathologie sous-jacente à plusieurs maladies telles que la progression tumorale et les métastases ^2,3. L’isolement et l’analyse efficaces de la sEV sont essentiels pour identifier les biomarqueurs et concevoir de futures interventions médicamenteuses.

Avec la recherche continue sur l’application clinique de sEV, les méthodes d’isolement de sEV ont mis en avant des exigences plus élevées. En raison de l’hétérogénéité des EV en termes de taille, de source et de contenu, ainsi que de leur similitude avec d’autres EV dans les propriétés physico-chimiques et biochimiques, il n’existe pas de méthode standard pour l’isolement des EV ^4,5. Actuellement, l’ultracentrifugation, la chromatographie d’exclusion de taille (SEC), la précipitation par polymère et la capture d’immunoaffinité sont les méthodes d’isolation sEV les plus courantes⁶. L’ultracentrifugation est toujours l’étalon-or pour l’isolation des EV dans la recherche, bien qu’elle prenne beaucoup de temps, ce qui entraîne une faible pureté avec une large distribution de taille de 40 à 500 nm et des dommages mécaniques importants au sEV après une centrifugation à long terme ^7,8,9. La précipitation des polymères, qui utilise habituellement du polyéthylène glycol (PEG), souffre d’une pureté inacceptable pour l’analyse fonctionnelle ultérieure avec précipitation concomitante d’agrégats de protéines extracellulaires et contamination par les polymères^10,11. Les méthodes basées sur la capture d’immunoaffinité nécessitent des anticorps coûteux avec des spécificités variables, ainsi que des problèmes de faible volume de traitement et de rendements^12,13,14. La taille des particules est l’un des principaux indicateurs pour évaluer la pureté du sEV isolé. Bien que la pureté du sEV reste un objectif inaccessible, la SEC élimine une quantité considérable de composants du milieu, et les particules de sEV extraites par la méthode SEC sont principalement comprises entre 50 et 200 nm¹⁵. Les techniques existantes présentent quelques inconvénients, y compris, mais sans s’y limiter, le fait qu’elles prennent beaucoup de temps, qu’elles soient peu pures, à faible rendement, à faible reproductibilité, à faible débit d’échantillons et à des dommages potentiels de sEV, ce qui les rend incompatibles avec l’utilisation clinique¹⁶. Ainsi, une méthode d’isolation de la SVE rapide, peu coûteuse et de taille spécifiée applicable à divers biofluides est un besoin essentiel dans plusieurs situations cliniques et de recherche.

En cytométrie en flux, les particules uniques sont analysées de manière multiparamétrique à haut débit et les sous-ensembles sont triés¹⁷. En raison de l’hétérogénéité des VE, une mesure cytométrique en flux de particules uniques serait idéale, qui a été utilisée pour étudier les VE suivant les paradigmes de l’analyse cellulaire, avec des marqueurs de diffusion de la lumière et de fluorescence utilisés pour identifier les caractéristiques liées à la physiologie et les composants protéiques^18,19,20. Néanmoins, la cytométrie de flux conventionnelle est remise en question par la petite taille de sEV et la faible abondance de biomarqueurs de surface. La sensibilité de la cytométrie en flux pourrait être améliorée en optimisant les paramètres de détection pour distinguer le bruit de fond et le sEV, indépendamment de l’utilisation du paramètre de déclenchement de la diffusion directe (FSC), de la diffusion latérale (SSC) ou du seuil de fluorescence¹⁹.

Avec le protocole actuel, les paramètres de tri cytométrique en flux à haute résolution ont été optimisés en utilisant des billes fluorescentes en standard. En sélectionnant la taille de buse, la pression du fluide de gaine, le paramètre de déclenchement du seuil et les tensions contrôlant les intensités lumineuses diffusées, nous avons pu isoler un sous-ensemble spécifique de sEV d’un mélange complexe.