接合子のCRISPRエレクトロポレーションによるマウスの効率的なゲノム編集
Summary
ここでは、CRISPR RNP接合子のエレクトロポレーション(CRISPR-EZ)と呼ばれる遺伝子改変マウスの効率的な生成を目的とした簡単な手法について説明します。この方法は、編集試薬をエレクトロポレーションにより胚に100%に近い効率で送達する。このプロトコルは、哺乳類胚における点突然変異、小さなゲノム挿入、および欠失に効果的です。
Abstract
卓越した効率、精度、および容易さを備えたCRISPR/Cas9システムは、細胞培養および実験動物実験におけるゲノム編集を大幅に改善しました。動物モデルを生成する場合、接合子のエレクトロポレーションは、マイクロインジェクションのゴールドスタンダード法の代替として、より高い効率、シンプルさ、コスト、およびスループットを提供します。エレクトロポレーションはまた、より穏やかで生存率が高く、Cas9 /シングルガイドRNA(sgRNA)リボ核タンパク質(RNP)を一般的な実験用マウス系統(C57BL / 6JおよびC57BL / 6Nなど)の接合子に確実に送達し、100%の送達効率に近づきます。この手法により、挿入/欠失(インデル)変異、点突然変異、遺伝子またはエクソン全体の欠失、およびLoxPまたはFLAG、HA、V5などの短いタグを挿入するための100〜200 bpの範囲の小さな挿入が可能になります。ここでは、絶えず改善されていますが、in vitro 転写、胚処理、RNPアセンブリ、エレクトロポレーション、着床前胚のジェノタイピングによるsgRNA産生を含むプロトコルでCRISPR-EZの現状を示します。胚の操作経験が最小限の大学院レベルの研究者は、このプロトコルを使用して1週間未満で遺伝子編集された胚を取得できます。ここでは、マウス胚に使用できる、簡単で低コスト、効率的、大容量の方法を提供します。
Introduction
生きたマウスでのゲノム編集は、CRISPR編集の出現以来、かなり簡素化され、アクセスしやすく、より手頃な価格になりました1,2,3。最初の動物編集の試みでは、マイクロインジェクションを使用してCRISPR Cas9 mRNA/sgRNAを核期胚に送達しました4,5,6。マイクロインジェクションは非常に効果的ですが、それを完全に習得するために必要な練習の量は、研修生や学生には適切ではない可能性があり、適度な資金のあるラボでは購入できない高価な機器も必要です。マイクロインジェクションは通常、トランスジェニック施設の専門技術者によって行われ、多くの研究者にとってレート制限のあるスケジュールとサービス価格があります。よりアクセスしやすいアプローチはエレクトロポレーションのアプローチであり、これはCRISPR Cas9 mRNA/sgRNAの前核段階の胚への送達に非常に効果的であることが実証されています7。CRISPRゲノム編集および送達戦略のさらなる改善は、すでにsgRNAと結合している事前に組み立てられたRNPがモザイク現象を低減する効果的な手段である可能性があることを示唆しました8。
このプロトコルの開発と使用の背後にある理論的根拠は、マイクロインジェクションに関連する制限と障害の多くを回避することでした。名前が示すように、マイクロインジェクション実験中にテストされていないsgRNAデザインを使用する価値があるかどうかを迅速に判断できる、簡単で社内の費用対効果の高い方法は、非常に便利なファーストパス品質管理ステップです(図1)。この方法は、組換えベースの結果のために長いドナーDNA配列を導入するなど、より複雑な戦略ではマイクロインジェクションに取って代わることはできませんが、小さな欠失や挿入、遺伝子のタグ付けなどのそれほど複雑でない戦略には理想的です。この方法は、基本的な胚操作スキルを持つ研究者で、単純な編集ニーズを持っている、着床前の開発の時間枠内で仮説をテストしたい、またはマイクロインジェクションの専門家との予約をスケジュールする前に胚でsgRNAをテストしたい研究者に適しています。ここでは、編集試薬は、エレクトロポレーション(一連の電気パルス )を介して Cas9 / sgRNPとして核段階の胚に一過性に送達され、モザイク現象を減らしながら効率を最大化します8。胚ジェノタイピング法を使用すると、編集結果は約1週間9で利用可能になるため、大幅に削減されたコストでさまざまなマイクロインジェクションアプリケーションの必要性が減少します。
この方法の有効性は、胚がまだ母方と父方の前核を融合していない、またはS期に入っていない前核胚段階でピークに達します(図2)。過排卵は接合子の数を最大化するために使用されますが、前核接合子と未受精卵の両方を生成します。健康な接合子は、エレクトロポレーションの前に事前に選択して、全体的な効率を高めることもできます。他のエレクトロポレーションプロトコルは、同様のステップ7、10、11、12、13、14、15を含む必要なしに接合子を効率的に編集しているので、このプロトコルのオプションのステップは、透明帯(ZP)のわずかな侵食である。ZPは、精子の結合、先体反応、および前核段階の胚を取り巻く受精を助ける糖タンパク質層です。私たちの経験では、ZPの穏やかな酸ベースの侵食は、生存率にわずかな影響しか及ぼさずに、信頼性の高いCas9 RNPエレクトロポレーション送達を提供することがわかりました。
C57BL/6JやC57BL/6N 9,16などの研究で一般的に使用されているマウス系統において、エレクトロポレーションによる最大100%の効率のRNP送達率が観察されています。独立したグループはまた、マイクロインジェクション11、12、13、14、15、17よりも高い、またはそれと一致する効率のエレクトロポレーションベースの手順を開発し、エレクトロポレーションプロトコルはラット18、19、ブタ20、21、22、およびウシ23で良好に機能しています。したがって、読者はプロトコルを比較して、実験および機器のニーズに最適な条件を見つけることをお勧めします。ここで説明するシステムは、一般的な材料と機器を使用しており、基本的な胚操作スキルのみを必要とします。この手法は、さまざまな編集戦略に効果的であり、研究コミュニティがこの方法を広く利用できるようにします。
理想的な低分子ガイドRNA(sgRNA)を設計することは、効率的な編集に不可欠です。特にマウス系統の作製が必要な場合は、マウス胚の標的部位ごとに2〜3個のsgRNA戦略を直接スクリーニングすることをお勧めします。設計後は、高品質のsgRNAを作製するためのin vitro転写(IVT)などのクローニングフリーの方法が推奨されます3。RNPおよびsgRNAは、30〜50個の処理された前核期胚と混合され、一連の電気パルスにさらされて最初にZPおよび細胞膜を一時的に透過し、その後のパルスで孔を開いたままにし、接合子24を通してRNPを電気泳動します。最適化の結果、バルク胚(~50)に対して30 Vで6つの3 msパルスが編集効果と生存率に最適であり、非常に効率的なCas9/sgRNA RNP送達を提供することがわかりました9,16,25。個々のマウス桑実胚における編集イベントは、制限断片長多型(RFLP)、T7エンドヌクレアーゼ消化、および関心領域のサンガーシーケンシングなど、CRISPR編集に一般的なさまざまな検証戦略を使用して確認できます26。
現在の方法は、挿入/欠失(インデル)、500〜2000 bp程度のエクソンサイズの欠失、およびC末端またはN末端タグ(FLAG、HA、V5など)などの点突然変異や小さな挿入の送達などの単純な編集スキーム(図3)に最も適しています9,16,27。蛍光タグや条件付き対立遺伝子の大規模な挿入のような複雑なゲノム編集の可能性は依然として不確実であり、今後の改善の現在の焦点です。
この方法は容易に習得でき、培養マウス胚のsgRNAを1週間で迅速に試験するために使用できます9(図1)。この研究で提示されているのは、1)sgRNAデザインを含む6段階のプロトコルです。2)sgRNA合成;3)過剰排卵および交尾;4)胚の培養、収集、および処理。5)RNPアセンブリとエレクトロポレーション。6)胚培養とジェノタイピング。使用されているすべての材料に関する情報が提供されています(材料表)。陽性対照として、チロシナーゼ(Tyr)遺伝子座9,16を編集する試薬が付表1に含まれている。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、簡単で高効率なマウスゲノム編集技術を紹介します。エレクトロポレーションは、1〜2週間で改変胚を生成するために使用でき(図1)、6週間以内に編集されたマウスを作製することができる9。RNP 7、10、11、12、13、14、15、<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.J.M.は、CRISPR-EZの開発につながる独自のコンセプトを作成し、フィギュアを作成しました。C.K.D.は、この現在の原稿のために内部および公開されたプロトコルを編集および適応させました。A.J.M. は NIH (R00HD096108) によってサポートされています。
Materials
| 0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
| 26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
| 3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
| 35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
| 60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
| 6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
| BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
| Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
| DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
| DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
| EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
| EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
| Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
| Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
| Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
| Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
| HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
| HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
| Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
| Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
| KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
| LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
| Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
| Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
| Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
| Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
| High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
| Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
| Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
| Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
| RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
| Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
| Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
| Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
- Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
- Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
- Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
- Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
- Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
- Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
- Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
- Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
- Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
- Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
