Édition efficace du génome de souris par électroporation CRISPR de zygotes

L’édition du génome chez la souris vivante a été considérablement simplifiée et est devenue accessible et plus abordable depuis l’émergence de l’édition CRISPR ^1,2,3. Les premières tentatives d’édition animale ont utilisé la micro-injection pour délivrer l’ARNm/ARNsg CRISPR Cas9 dans des embryons au stade pronucléaire ^4,5,6. Bien que la micro-injection soit assez efficace, la quantité de pratique requise pour la maîtriser pleinement pourrait ne pas convenir aux stagiaires et aux étudiants et nécessite également un équipement coûteux qu’un laboratoire modestement financé n’est pas en mesure de se permettre. La micro-injection est normalement effectuée par des techniciens experts dans des installations transgéniques dont les horaires et les prix des services limitent le taux pour de nombreux chercheurs. Une approche plus accessible est celle de l’électroporation, qui s’est avérée très efficace pour l’administration de l’ARNm/ARNsg Cas9 CRISPR dans des embryons au stade pronucléaire⁷. D’autres améliorations dans les stratégies d’édition et de livraison du génome CRISPR suggèrent que les RNP pré-assemblés déjà engagés avec des sgRNA peuvent être un moyen efficace de réduire le mosaïcisme⁸.

La raison d’être de l’élaboration et de l’utilisation de ce protocole était de contourner bon nombre des limites et des obstacles associés à la micro-injection. Comme son nom l’indique, une méthode simple, interne et rentable qui pourrait rapidement déterminer si des conceptions d’ARNg non testées vaudraient la peine d’être utilisées lors d’une expérience de micro-injection serait une étape de contrôle de la qualité de premier passage très pratique (Figure 1). Bien que cette méthode ne puisse pas remplacer la microinjection pour des stratégies plus complexes, comme l’introduction de longues séquences d’ADN de donneur pour des résultats basés sur la recombinaison, elle est idéale pour les stratégies moins complexes telles que les petites délétions ou insertions et le marquage des gènes. Cette méthode convient aux chercheurs ayant des compétences de base en manipulation d’embryons qui ont des besoins d’édition simples, qui souhaitent tester leur hypothèse dans le délai de développement préimplantatoire ou préfèrent tester les ARNg dans les embryons avant de prendre rendez-vous avec un spécialiste de la micro-injection. Ici, les réactifs d’édition sont délivrés transitoirement dans des embryons au stade pronucléaire sous forme de RNP Cas9 / sgRNA par électroporation (une série d’impulsions électriques) pour maximiser l’efficacité tout en diminuant le mosaïcisme⁸. En utilisant une méthode de génotypage embryonnaire, les résultats d’édition sont disponibles en environ 1 semaine⁹, réduisant ainsi le besoin de diverses applications de micro-injection à un coût considérablement réduit.

L’efficacité de cette méthode culmine au stade embryonnaire pronucléaire, lorsque l’embryon n’a pas encore fusionné les pronuclei maternel et paternel ou n’est pas encore entré en phase S (Figure 2). La superovulation est utilisée pour maximiser le nombre de zygotes mais produit à la fois des zygotes pronucléaires et des œufs non fécondés. Les zygotes sains peuvent également être présélectionnés avant l’électroporation pour augmenter l’efficacité globale. Comme d’autres protocoles d’électroporation ont efficacement édité les zygotes sans qu’il soit nécessaire d’inclure une étape similaire 7,10,11,12,13,14,15^, une étape facultative de ce protocole est la légère érosion de la zone pellucide (ZP). Le ZP est une couche de glycoprotéine qui facilite la liaison des spermatozoïdes, la réponse acrosomique et la fécondation autour des embryons au stade pronucléaire. D’après notre expérience, nous avons constaté qu’une légère érosion à base d’acide du ZP fournit une administration fiable de l’électroporation Cas9 RNP avec seulement un impact marginal sur la viabilité.

Nous avons observé des taux d’administration de RNP allant jusqu’à 100% d’efficacité par électroporation dans des souches de souris couramment utilisées dans la recherche comme C57BL / 6J et C57BL / 6N ^9,16. Des groupes indépendants ont également mis au point des procédures basées sur l’électroporation avec des rendements supérieurs ou équivalents à la microinjection 11,12,13,14,15,17, avec des protocoles d’électroporation fonctionnant bien chez le rat^18,19, le porc 20,21,22 et la vache ²³ , nous suggérons donc aux lecteurs de comparer les protocoles pour trouver les conditions qui répondent le mieux à leurs besoins expérimentaux et d’équipement. Le système décrit ici utilise des matériaux et des équipements communs, ne nécessitant que des compétences de base en manipulation d’embryons. Cette technique est efficace pour une gamme de stratégies de révision, ce qui rend cette méthode largement accessible à la communauté de la recherche.

La conception de petits ARN guides idéaux (ARNsg) est essentielle pour une édition efficace. Nous recommandons de dépister deux à trois stratégies d’ARNg par site cible directement dans les embryons de souris, en particulier si la génération de lignées de souris est souhaitée. Une fois conçues, les méthodes sans clonage comme la transcription in vitro (IVT) pour produire des sgRNA de haute qualité sont recommandées³. Les RNP et les ARNg sont mélangés avec 30 à 50 embryons traités au stade pronucléaire et exposés à une série d’impulsions électriques pour perméabiliser d’abord temporairement la ZP et la membrane cellulaire, puis pour maintenir les pores ouverts et électrophorèse les RNP à travers le zygote²⁴. Après optimisation, nous avons constaté que six impulsions de 3 ms à 30 V pour les embryons en vrac (~50) étaient optimales pour l’efficacité et la viabilité de l’édition, fournissant une livraison très efficace de Cas9 / sgRNA RNP ^9,16,25. Les événements d’édition dans la morula de souris individuelle peuvent être confirmés à l’aide d’une variété de stratégies de validation communes à l’édition CRISPR, telles que le polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP), la digestion de l’endonucléase T7 et le séquençage de Sanger de la région d’intérêt²⁶.

La méthode actuelle est la plus appropriée pour les schémas d’édition simples (Figure 3), tels que l’insertion/suppression (indels), les suppressions de la taille d’un exon de l’ordre de 500-2000 pb, et la livraison de mutations ponctuelles et de petites insertions telles que les balises C- ou N-Terminal (par exemple, FLAG, HA ou V5)^9,16,27. Le potentiel d’édition complexe du génome, comme de grandes insertions de marqueurs fluorescents ou d’allèles conditionnels, reste incertain et fait actuellement l’objet d’améliorations à venir.

Cette méthode est facilement maîtrisable et peut être utilisée pour tester rapidement les ARNg dans des embryons de souris en culture en 1 semaine⁹ (Figure 1). Ce travail présente un protocole en six étapes, qui comprend 1) la conception de l’ARNg; 2) synthèse de l’ARNg; 3) la superovulation et l’accouplement; 4) la culture, la collecte et le traitement d’embryons; 5) assemblage et électroporation RNP; 6) culture embryonnaire et génotypage. Des informations sur tous les matériaux utilisés sont fournies (Tableau des matériaux). En tant que contrôle positif, les réactifs pour modifier le locus ^9,16 de la tyrosinase (Tyr) ont été inclus dans le tableau supplémentaire 1.