Edição Eficiente do Genoma de Camundongos por Eletroporação CRISPR de Zigotos

A edição do genoma em camundongos vivos foi consideravelmente simplificada e tornou-se acessível e mais acessível desde o surgimento da edição CRISPR ^1,2,3. Tentativas iniciais de edição animal utilizaram microinjeção para entregar mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 em embriões em estágio pronuclear ^4,5,6. Embora a microinjeção seja bastante eficaz, a quantidade de prática necessária para dominá-la totalmente pode não ser apropriada para estagiários e estudantes e também requer equipamentos caros que um laboratório modestamente financiado não pode pagar. A microinjeção é normalmente realizada por técnicos especializados em instalações transgênicas com horários e preços de serviços que limitam a taxa para muitos pesquisadores. Uma abordagem mais acessível é a da eletroporação, que tem se mostrado bastante eficaz para a entrega de mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 em embriões em estágio pronuclear⁷. Outras melhorias nas estratégias de edição e entrega do genoma CRISPR sugeriram que RNPs pré-montados já envolvidos com sgRNAs podem ser um meio eficaz para reduzir o mosaicismo⁸.

A lógica por trás do desenvolvimento e uso deste protocolo foi ignorar muitas das limitações e obstáculos associados à microinjeção. Como o nome indica, um método fácil, interno e econômico que pudesse determinar rapidamente se os projetos de sgRNA não testados valeriam a pena usar durante um experimento de microinjeção seria uma etapa de controle de qualidade de primeira passagem muito conveniente (Figura 1). Embora esse método não possa substituir a microinjeção por estratégias mais complexas, como a introdução de longas sequências de DNA de doadores para resultados baseados em recombinação, é ideal para estratégias menos complexas, como pequenas deleções ou inserções e genes de marcação. Este método é apropriado para pesquisadores com habilidades básicas de manipulação de embriões que têm necessidades simples de edição, gostariam de testar sua hipótese dentro do período de tempo de desenvolvimento pré-implantacional ou preferem testar sgRNAs em embriões antes de agendar uma consulta com um especialista em microinjeção. Aqui, os reagentes de edição são entregues transitoriamente em embriões de estágio pronuclear como RNPs Cas9/sgRNA via eletroporação (uma série de pulsos elétricos) para maximizar a eficiência enquanto diminui o mosaicismo⁸. Usando um método de genotipagem embrionária, os resultados da edição estão disponíveis em aproximadamente 1 semana⁹, reduzindo assim a necessidade de várias aplicações de microinjeção a um custo significativamente reduzido.

A eficácia desse método atinge o pico no estágio embrionário pró-nuclear, quando o embrião ainda não fundiu os pronúcleos materno e paterno ou entrou na fase S (Figura 2). A superovulação é usada para maximizar o número de zigotos, mas produz zigotos pró-nucleares e óvulos não fertilizados. Zigotos saudáveis também podem ser pré-selecionados antes da eletroporação para aumentar a eficiência geral. Como outros protocolos de eletroporação têm editado zigotos de forma eficiente sem a necessidade de incluir uma etapa semelhante^{7,10,11,12,13,14,15,} uma etapa opcional deste protocolo é a ligeira erosão da zona pelúcida (ZP). A ZP é uma camada de glicoproteína que auxilia a ligação dos espermatozoides, a resposta do acrossoma e a fertilização em torno de embriões em estágio pró-nuclear. Em nossa experiência, descobrimos que uma erosão suave à base de ácido do ZP fornece entrega confiável de eletroporação de RNP Cas9 com apenas um impacto marginal na viabilidade.

Observamos taxas de entrega de RNP de até 100% de eficiência via eletroporação em cepas de camundongos que são comumente utilizadas em pesquisas como C57BL/6J e C57BL/6N ^9,16. Grupos independentes também desenvolveram procedimentos baseados em eletroporação com eficiências maiores ou correspondentes à microinjeção 11,12,13,14,15,17, com protocolos de eletroporação funcionando bem em ratos ^18,19, suínos 20,21,22 e vacas ²³ , por isso, sugerimos que os leitores comparem os protocolos para encontrar as condições que melhor se adequam às suas necessidades experimentais e de equipamento. O sistema descrito aqui usa materiais e equipamentos comuns, exigindo apenas habilidades básicas de manipulação de embriões. Esta técnica é eficaz para uma série de estratégias de edição, tornando este método amplamente acessível à comunidade de pesquisa.

Projetar RNAs de guia pequeno ideais (sgRNAs) é essencial para uma edição eficiente. Recomendamos o rastreamento de duas a três estratégias de sgRNA por local-alvo diretamente em embriões de camundongos, especialmente se a geração de linhagem de camundongo for desejada. Uma vez projetados, métodos livres de clonagem, como a transcrição in vitro (IVT) para produzir sgRNAs de alta qualidade, são recomendados³. Os RNPs e sgRNAs são misturados com 30-50 embriões processados em estágio pronuclear e expostos a uma série de pulsos elétricos para primeiro permeabilizar temporariamente o ZP e a membrana celular, com pulsos subsequentes para manter os poros abertos e eletroforese os RNPs através do zigoto²⁴. Após otimização, descobrimos que seis pulsos de 3 ms a 30 V para embriões a granel (~50) foram ótimos para a eficácia e viabilidade da edição, proporcionando uma entrega de RNP Cas9/sgRNA altamente eficiente ^9,16,25. Eventos de edição em morula de camundongo individual podem ser confirmados usando uma variedade de estratégias de validação comuns para edição CRISPR, como polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), digestão de endonuclease T7 e sequenciamento de Sanger da região de interesse²⁶.

O método atual é mais apropriado para esquemas de edição simples (Figura 3), como inserção/exclusão (indels), exclusões de tamanho exonário na ordem de 500-2000 pb e a entrega de mutações pontuais e pequenas inserções, como tags C- ou N-Terminal (por exemplo, FLAG, HA ou V5)^9,16,27. O potencial para a edição complexa do genoma, como grandes inserções de tags fluorescentes ou alelos condicionais, permanece incerto e é o foco atual das próximas melhorias.

Este método é facilmente dominado e pode ser usado para testar rapidamente sgRNAs em embriões de camundongos cultivados em 1 semana⁹ (Figura 1). Apresentado neste trabalho é um protocolo de seis etapas, que inclui 1) desenho de sgRNA; 2) síntese de sgRNA; 3) superovulação e acasalamento; 4) cultura, coleta e processamento de embriões; 5) Montagem e eletroporação da RNP; 6) cultura embrionária e genotipagem. Informações sobre todos os materiais utilizados são fornecidas (Tabela de Materiais). Como controle positivo, os reagentes para edição do locus tirosinase (Tyr) ^9,16 foram incluídos na Tabela Suplementar 1.