עריכה גנומית יעילה של עכברים על ידי CRISPR אלקטרופורציה של זיגוטים
Summary
במאמר זה אנו מתארים טכניקה פשוטה המיועדת לייצור יעיל של עכברים מהונדסים גנטית הנקראת CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). שיטה זו מספקת ריאגנטים לעריכה על ידי אלקטרופורציה לעוברים ביעילות המתקרבת ל-100%. פרוטוקול זה יעיל עבור מוטציות נקודתיות, החדרות גנומיות קטנות ומחיקות בעוברי יונקים.
Abstract
עם יעילות, דיוק וקלות יוצאי דופן, מערכת CRISPR/Cas9 שיפרה באופן משמעותי את עריכת הגנום בתרביות תאים ובניסויים בחיות מעבדה. בעת יצירת מודלים של בעלי חיים, אלקטרופורציה של זיגוטות מציעה יעילות גבוהה יותר, פשטות, עלות ותפוקה, כחלופה לשיטת תקן הזהב של מיקרו-הזרקה. אלקטרופורציה היא גם עדינה יותר, עם כדאיות גבוהה יותר, ומספקת באופן אמין Cas9/Single guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteins (RNPs) לתוך הזיגוטה של זני עכברי מעבדה נפוצים (למשל, C57BL/6J ו-C57BL/6N) שמתקרבים ל-100% יעילות מסירה. טכניקה זו מאפשרת החדרה/מחיקה (indels) מוטציות, מוטציות נקודתיות, מחיקה של גנים שלמים או אקסונים, והחדרות קטנות בטווח של 100-200 bp כדי להכניס LoxP או תגים קצרים כמו FLAG, HA או V5. תוך שיפור מתמיד, כאן אנו מציגים את המצב הנוכחי של CRISPR-EZ בפרוטוקול הכולל ייצור sgRNA באמצעות שעתוק חוץ גופי , עיבוד עוברים, הרכבת RNP, אלקטרופורציה וגנוטיפ של עוברים טרום השרשה. חוקר ברמת בוגר עם ניסיון מינימלי במניפולציה של עוברים יכול להשיג עוברים ערוכים גנטית תוך פחות משבוע באמצעות פרוטוקול זה. כאן, אנו מציעים שיטה פשוטה, זולה, יעילה ובעלת קיבולת גבוהה שניתן להשתמש בה עם עוברי עכבר.
Introduction
עריכת גנום בעכברים חיים פשטה במידה ניכרת והפכה לנגישה וזולה יותר מאז הופעתה של עריכת CRISPR 1,2,3. ניסיונות עריכה ראשוניים של בעלי חיים השתמשו במיקרו-הזרקה כדי להעביר CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA לעובריםבשלב הגרעיני 4,5,6. בעוד מיקרו-הזרקה יעילה למדי, כמות התרגול הנדרשת כדי לשלוט בה באופן מלא עשויה שלא להתאים למתאמנים ולסטודנטים וגם דורשת ציוד יקר שמעבדה במימון צנוע אינה יכולה להרשות לעצמה. מיקרו-הזרקה מבוצעת בדרך כלל על ידי טכנאים מומחים במתקנים טרנסגניים עם לוחות זמנים ומחירי שירות המגבילים את התעריף עבור חוקרים רבים. גישה נגישה יותר היא זו של אלקטרופורציה, אשר הוכחה כיעילה למדי להעברת CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA לעוברים בשלב גרעיני7. שיפורים נוספים באסטרטגיות העריכה והמסירה של גנום CRISPR הצביעו על כך ש-RNPs שהורכבו מראש וכבר עוסקים ב-sgRNA עשויים להיות אמצעי יעיל להפחתת פסיפס8.
הרציונל מאחורי הפיתוח והשימוש בפרוטוקול זה היה לעקוף רבות מהמגבלות והמכשולים הקשורים למיקרו-הזרקה. כפי שהשם מרמז, שיטה קלה, פנימית וחסכונית שיכולה לקבוע במהירות אם תכנוני sgRNA שלא נבדקו יהיו כדאיים לשימוש במהלך ניסוי מיקרו-הזרקה תהיה שלב בקרת איכות מעבר ראשון נוח מאוד (איור 1). בעוד ששיטה זו אינה יכולה להחליף מיקרו-הזרקה לאסטרטגיות מורכבות יותר, כמו החדרת רצפי דנ”א ארוכים של תורמים לתוצאות מבוססות רקומבינציה, היא אידיאלית לאסטרטגיות פחות מורכבות כמו מחיקות קטנות או החדרות ותיוג גנים. שיטה זו מתאימה לחוקרים בעלי מיומנויות בסיסיות של מניפולציה בעוברים שיש להם צרכי עריכה פשוטים, המעוניינים לבחון את ההשערה שלהם במסגרת הזמן של התפתחות טרום השרשה, או מעדיפים לבדוק sgRNA בעוברים לפני קביעת פגישה עם מומחה מיקרו-הזרקה. כאן, ריאגנטים עורכים מועברים באופן זמני לעוברים בשלב הגרעיני כמו Cas9/sgRNA RNPs באמצעות אלקטרופורציה (סדרה של פולסים חשמליים) כדי למקסם את היעילות תוך הפחתת פסיפס8. בשיטת גנוטיפ עוברי, תוצאות העריכה זמינות תוך כשבוע9, ובכך מפחיתות את הצורך ביישומי מיקרו-הזרקה שונים בעלות מופחתת משמעותית.
יעילותה של שיטה זו מגיעה לשיאה בשלב העובר הפרו-גרעיני, כאשר העובר עדיין לא התיך את גרעיני האם והאב או נכנס לשלב S (איור 2). סופרביולציה משמשת למקסום מספר הזיגוטה אך מייצרת גם זיגוטות פרו-גרעיניות וגם ביציות לא מופרות. ניתן גם לבחור מראש זיגוטים בריאים לפני אלקטרופורציה כדי להגביר את היעילות הכוללת. מכיוון שפרוטוקולי אלקטרופורציה אחרים ערכו זיגוטות ביעילות ללא צורך לכלול שלב דומה 7,10,11,12,13,14,15, שלב אופציונלי בפרוטוקול זה הוא שחיקה קלה של הזונה פלוצ’ידה (ZP). ZP היא שכבת גליקופרוטאין המסייעת לקשירת זרעונים, תגובת אקרוזום והפריה סביב עוברים בשלב הגרעיני. מניסיוננו, מצאנו כי שחיקה עדינה על בסיס חומצה של ZP מספקת אספקת אלקטרופורציה Cas9 RNP אמינה עם השפעה שולית בלבד על הכדאיות.
ראינו קצבי העברת RNP של עד 100% יעילות באמצעות אלקטרופורציה בזני עכברים המשמשים בדרך כלל במחקר כמו C57BL/6J ו- C57BL/6N 9,16. קבוצות עצמאיות פיתחו גם נהלים מבוססי אלקטרופורציה עם יעילות גדולה או תואמת מיקרו-הזרקה 11,12,13,14,15,17, עם פרוטוקולי אלקטרופורציה המתפקדים היטב בחולדות18,19, חזיר 20,21,22 ופרה 23 לכן אנו מציעים לקוראים להשוות את הפרוטוקולים כדי למצוא את התנאים המתאימים ביותר לצרכי הניסוי והציוד שלהם., המערכת המתוארת כאן משתמשת בחומרים ובציוד נפוצים, הדורשים רק מיומנויות בסיסיות של מניפולציה עוברית. טכניקה זו יעילה למגוון אסטרטגיות עריכה, מה שהופך שיטה זו לנגישה באופן נרחב לקהילת המחקר.
תכנון רנ”א מדריך קטן אידיאלי (sgRNAs) חיוני לעריכה יעילה. אנו ממליצים לסנן שתיים עד שלוש אסטרטגיות sgRNA לכל אתר מטרה ישירות בעוברי עכברים, במיוחד אם רוצים ליצור קו עכבר. לאחר התכנון, שיטות ללא שיבוט כמו שעתוק חוץ גופי (IVT) לייצור sgRNA באיכות גבוהה מומלצות3. ה-RNPs וה-sgRNA מעורבבים עם 30-50 עוברים מעובדים בשלב הגרעיני ונחשפים לסדרה של פולסים חשמליים כדי לחדור תחילה באופן זמני את ה-ZP ואת קרום התא, עם פולסים עוקבים כדי לשמור על הנקבוביות פתוחות ואלקטרופורזה של ה-RNPs דרך הזיגוטה24. לאחר אופטימיזציה, מצאנו כי שישה פולסים של 3 מילישניות ב- 30 V עבור עוברים בתפזורת (~ 50) היו אופטימליים ליעילות עריכה וכדאיות, וסיפקו משלוח יעיל ביותר של Cas9/sgRNA RNP 9,16,25. ניתן לאשר עריכת אירועים במורולה של עכבר בודד באמצעות מגוון אסטרטגיות אימות נפוצות לעריכת קריספר, כגון פולימורפיזם אורך מקטע הגבלה (RFLP), עיכול אנדונוקלאז T7 וריצוף סנגר של אזור העניין26.
השיטה הנוכחית מתאימה ביותר לסכמות עריכה פשוטות (איור 3), כגון הכנסה/מחיקות (indels), מחיקות בגודל אקסון בסדר גודל של 500-2000 bp, והעברת מוטציות נקודתיות ותוספות קטנות כגון תגי C- או N-Terminal (לדוגמה, FLAG, HA או V5)9,16,27. הפוטנציאל לעריכת גנום מורכבת, כמו החדרות גדולות של תגים פלואורסצנטיים או אללים מותנים, נותר לא ברור והוא המוקד הנוכחי של שיפורים עתידיים.
קל לשלוט בשיטה הזו, וניתן להשתמש בה כדי לבדוק במהירות sgRNA בעוברי עכברים בתרבית בשבוע9 (איור 1). בעבודה זו מוצג פרוטוקול בן שישה שלבים, הכולל 1) תכנון sgRNA; 2) סינתזת sgRNA; 3) ביוץ יתר והזדווגות; 4) תרבית עוברים, איסוף ועיבוד; 5) הרכבת RNP והתחשמלות; 6) תרבית עוברים וגנוטיפ. מידע על כל החומרים בהם נעשה שימוש מסופק (טבלת חומרים). כבקרה חיובית, ריאגנטים לעריכת מוקד הטירוזינאז (Tyr) 9,16 נכללו בטבלה המשלימה 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
מוצגת כאן טכנולוגיה פשוטה ויעילה ביותר לעריכת גנום עכבר. אלקטרופורציה יכולה לשמש ליצירת עוברים שעברו שינוי תוך שבוע-שבועיים (איור 1) ויכולה לייצר עכברים ערוכים תוך 6 שבועות9. בהשוואה לפרוטוקולים מבוססי אלקטרופורציה שפותחו במקביל ומספקים RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
איי.ג’.אם יצר את הקונספט המקורי שהוביל לפיתוח CRISPR-EZ והפיק את הדמויות. סי.קיי.די ליקט והתאים את הפרוטוקולים הפנימיים והמפורסמים לכתב היד הנוכחי. A.J.M. נתמך על ידי NIH (R00HD096108).
Materials
| 0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
| 26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
| 3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
| 35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
| 60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
| 6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
| BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
| Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
| DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
| DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
| EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
| EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
| Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
| Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
| Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
| Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
| HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
| HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
| Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
| Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
| KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
| LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
| Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
| Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
| Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
| Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
| High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
| Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
| Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
| Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
| RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
| Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
| Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
| Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
- Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
- Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
- Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
- Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
- Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
- Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
- Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
- Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
- Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
- Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
