Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

L’editing del genoma nei topi vivi è stato notevolmente semplificato ed è diventato accessibile e più conveniente dall’emergere dell’editing CRISPR ^1,2,3. I primi tentativi di modifica animale hanno utilizzato la microiniezione per fornire mRNA / sgRNA CRISPR Cas9 in embrioni in stadio pronucleare ^4,5,6. Mentre la microiniezione è abbastanza efficace, la quantità di pratica richiesta per padroneggiarla completamente potrebbe non essere appropriata per tirocinanti e studenti e richiede anche attrezzature costose che un laboratorio finanziato modestamente non è in grado di permettersi. La microiniezione viene normalmente eseguita da tecnici esperti in strutture transgeniche con orari e prezzi di servizio che sono limitanti per molti ricercatori. Un approccio più accessibile è quello dell’elettroporazione, che si è dimostrata abbastanza efficace per la consegna di mRNA/sgRNA CRISPR Cas9 in embrioni in stadio pronucleare⁷. Ulteriori miglioramenti nelle strategie di editing e consegna del genoma CRISPR hanno suggerito che gli RNP pre-assemblati già impegnati con sgRNA possono essere un mezzo efficace per ridurre il mosaicismo⁸.

La logica alla base dello sviluppo e dell’uso di questo protocollo era quella di aggirare molte delle limitazioni e degli ostacoli associati alla microiniezione. Come suggerisce il nome, un metodo semplice, interno ed economico che potrebbe determinare rapidamente se vale la pena utilizzare progetti di sgRNA non testati durante un esperimento di microiniezione sarebbe una fase di controllo della qualità di primo passaggio molto conveniente (Figura 1). Mentre questo metodo non può sostituire la microiniezione per strategie più complesse, come l’introduzione di lunghe sequenze di DNA del donatore per risultati basati sulla ricombinazione, è ideale per strategie meno complesse come piccole delezioni o inserzioni e geni di marcatura. Questo metodo è appropriato per i ricercatori con competenze di base di manipolazione embrionale che hanno semplici esigenze di editing, vorrebbero testare la loro ipotesi entro il periodo di tempo dello sviluppo preimpianto o preferiscono testare gli sgRNA negli embrioni prima di fissare un appuntamento con uno specialista di microiniezione. Qui, i reagenti di editing vengono consegnati transitoriamente in embrioni in stadio pronucleare come RNP Cas9 / sgRNA tramite elettroporazione (una serie di impulsi elettrici) per massimizzare l’efficienza diminuendo il mosaicismo⁸. Utilizzando un metodo di genotipizzazione embrionale, i risultati di editing sono disponibili in circa 1 settimana⁹, riducendo così la necessità di varie applicazioni di microiniezione a un costo significativamente ridotto.

L’efficacia di questo metodo raggiunge il picco allo stadio embrionale pronucleare, quando l’embrione non ha ancora fuso i pronuclei materno e paterno o è entrato nella fase S (Figura 2). La superovulazione viene utilizzata per massimizzare il numero di zigoti, ma produce sia zigoti pronucleari che uova non fecondate. Gli zigoti sani possono anche essere preselezionati prima dell’elettroporazione per aumentare l’efficienza complessiva. Poiché altri protocolli di elettroporazione hanno modificato in modo efficiente gli zigoti senza la necessità di includere un passo simile 7,10,11,12,13,14,15^, un passo opzionale di questo protocollo è la leggera erosione della zona pellucida (ZP). La ZP è uno strato glicoproteico che aiuta il legame degli spermatozoi, la risposta degli acrosomiali e la fecondazione che circondano gli embrioni in stadio pronucleare. Nella nostra esperienza, abbiamo scoperto che una delicata erosione a base acida della ZP fornisce una consegna affidabile dell’elettroporazione Cas9 RNP con un impatto solo marginale sulla vitalità.

Abbiamo osservato tassi di rilascio di RNP fino al 100% di efficienza tramite elettroporazione in ceppi di topo che sono comunemente usati nella ricerca come C57BL / 6J e C57BL / 6N ^9,16. Gruppi indipendenti hanno anche sviluppato procedure basate sull’elettroporazione con efficienze superiori o corrispondenti alla microiniezione 11,12,13,14,15,17, con protocolli di elettroporazione che funzionano bene nel ratto^18,19, nel maiale 20,21,22 e nella mucca ²³ , quindi suggeriamo ai lettori di confrontare i protocolli per trovare le condizioni che meglio si adattano alle loro esigenze sperimentali e di attrezzature. Il sistema qui descritto utilizza materiali e attrezzature comuni, che richiedono solo abilità di manipolazione embrionale di base. Questa tecnica è efficace per una serie di strategie di editing, rendendo questo metodo ampiamente accessibile alla comunità di ricerca.

La progettazione di piccoli RNA guida ideali (sgRNA) è essenziale per un editing efficiente. Raccomandiamo lo screening di due o tre strategie di sgRNA per sito bersaglio direttamente negli embrioni di topo, specialmente se si desidera generare linee di topo. Una volta progettati, si raccomandano metodi privi di clonazione come la trascrizione in vitro (IVT) per produrre sgRNA di alta qualità³. Gli RNP e gli sgRNA sono mescolati con 30-50 embrioni in stadio pronucleare processati ed esposti a una serie di impulsi elettrici per prima permeabilizzare temporaneamente la ZP e la membrana cellulare, con impulsi successivi per mantenere i pori aperti ed elettroforese gli RNP attraverso lo zigote²⁴. Dopo l’ottimizzazione, abbiamo scoperto che sei impulsi da 3 ms a 30 V per embrioni di massa (~ 50) erano ottimali per l’efficacia e la vitalità dell’editing, fornendo una consegna altamente efficiente di Cas9 / sgRNA RNP ^9,16,25. Gli eventi di editing nella morula di topo possono essere confermati utilizzando una varietà di strategie di convalida comuni per l’editing CRISPR, come il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (RFLP), la digestione dell’endonucleasi T7 e il sequenziamento Sanger della regione di interesse²⁶.

Il metodo attuale è più appropriato per semplici schemi di editing (Figura 3), come inserimento/delezioni (indel), delezioni di dimensioni esone dell’ordine di 500-2000 bp e la consegna di mutazioni puntiformi e piccole inserzioni come tag C- o N-terminali (ad esempio, FLAG, HA o V5)^9,16,27. Il potenziale per l’editing del genoma complesso, come grandi inserzioni di tag fluorescenti o alleli condizionali, rimane incerto ed è attualmente al centro dei prossimi miglioramenti.

Questo metodo è facilmente padroneggiabile e può essere utilizzato per testare rapidamente gli sgRNA in embrioni di topo in coltura in 1 settimana⁹ (Figura 1). Presentato in questo lavoro è un protocollo in sei fasi, che include 1) progettazione di sgRNA; 2) sintesi di sgRNA; 3) superovulazione e accoppiamento; 4) coltura, raccolta e trattamento di embrioni; 5) assemblaggio RNP ed elettroporazione; 6) coltura embrionale e genotipizzazione. Vengono fornite informazioni su tutti i materiali utilizzati (Tabella dei materiali). Come controllo positivo, i reagenti per modificare il locus della tirosinasi (Tyr) ^9,16 sono stati inclusi nella tabella supplementare 1.