Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten
Summary
Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo’s met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo’s.
Abstract
Met uitzonderlijke efficiëntie, nauwkeurigheid en gemak heeft het CRISPR/Cas9-systeem de genoombewerking in celkweek en proefdierproeven aanzienlijk verbeterd. Bij het genereren van diermodellen biedt de elektroporatie van zygoten een hogere efficiëntie, eenvoud, kosten en doorvoer als alternatief voor de gouden standaardmethode van micro-injectie. Elektroporatie is ook zachter, met een hogere levensvatbaarheid, en levert op betrouwbare wijze Cas9/ single-guide RNA (sgRNA) ribonucleoproteïnen (RRP’s) in de zygoten van gewone laboratoriummuisstammen (bijv. C57BL / 6J en C57BL / 6N) die 100% leveringsefficiëntie benaderen. Deze techniek maakt insertie/deletie (indels) mutaties, puntmutaties, de deletie van hele genen of exonen en kleine inserties in het bereik van 100-200 bp mogelijk om LoxP of korte tags zoals FLAG, HA of V5 in te voegen. Hoewel voortdurend wordt verbeterd, presenteren we hier de huidige staat van CRISPR-EZ in een protocol dat sgRNA-productie omvat door in vitro transcriptie, embryoverwerking, RNP-assemblage, elektroporatie en de genotypering van pre-implantatieembryo’s. Een onderzoeker op graduate niveau met minimale ervaring in het manipuleren van embryo’s kan genetisch bewerkte embryo’s verkrijgen in minder dan 1 week met behulp van dit protocol. Hier bieden we een eenvoudige, goedkope, efficiënte methode met hoge capaciteit die kan worden gebruikt met muizenembryo’s.
Introduction
Genoombewerking bij levende muizen is aanzienlijk vereenvoudigd en is toegankelijker en betaalbaarder geworden sinds de opkomst van CRISPR-bewerking 1,2,3. Initiële bewerkingspogingen bij dieren gebruikten micro-injectie om CRISPR Cas9-mRNA/sgRNA af te leveren in embryo’s in het pronucleaire stadium 4,5,6. Hoewel micro-injectie vrij effectief is, is de hoeveelheid oefening die nodig is om het volledig onder de knie te krijgen misschien niet geschikt voor stagiairs en studenten en vereist het ook dure apparatuur die een bescheiden gefinancierd laboratorium zich niet kan veroorloven. Micro-injectie wordt normaal gesproken uitgevoerd door deskundige technici in transgene faciliteiten met schema’s en serviceprijzen die voor veel onderzoekers snelheidsbeperkend zijn. Een meer toegankelijke benadering is die van elektroporatie, waarvan is aangetoond dat deze vrij effectief is voor de afgifte van CRISPR Cas9-mRNA / sgRNA in embryo’s in het pronucleaire stadium7. Verdere verbeteringen in CRISPR-genoombewerkings- en leveringsstrategieën suggereerden dat voorgeassembleerde RRP’s die al betrokken zijn bij sgRNA’s een effectief middel kunnen zijn om mozaïcisme te verminderen8.
De reden achter de ontwikkeling en het gebruik van dit protocol was om veel van de beperkingen en obstakels in verband met micro-injectie te omzeilen. Zoals de naam al aangeeft, zou een eenvoudige, interne en kosteneffectieve methode die snel zou kunnen bepalen of niet-geteste sgRNA-ontwerpen de moeite waard zouden zijn om te gebruiken tijdens een micro-injectie-experiment, een zeer handige first pass kwaliteitscontrolestap zijn (figuur 1). Hoewel deze methode micro-injectie niet kan vervangen voor complexere strategieën, zoals het introduceren van lange donor-DNA-sequenties voor op recombinatie gebaseerde uitkomsten, is het ideaal voor minder complexe strategieën zoals kleine deleties of inserties en tagginggenen. Deze methode is geschikt voor onderzoekers met elementaire embryomanipulatievaardigheden die eenvoudige bewerkingsbehoeften hebben, hun hypothese willen testen binnen het tijdsbestek van pre-implantatieontwikkeling, of liever sgRNA’s in embryo’s testen voordat ze een afspraak plannen met een micro-injectiespecialist. Hier worden bewerkingsreagentia tijdelijk afgeleverd in embryo’s in het pronucleaire stadium als Cas9 / sgRNA RNPs via elektroporatie (een reeks elektrische pulsen) om de efficiëntie te maximaliseren en tegelijkertijd het mozaïcisme te verminderen8. Met behulp van een embryogenotyperingsmethode zijn bewerkingsresultaten beschikbaar in ongeveer 1 week9, waardoor de behoefte aan verschillende micro-injectietoepassingen tegen aanzienlijk lagere kosten wordt verminderd.
De effectiviteit van deze methode piekt in het pronucleaire embryostadium, wanneer het embryo de maternale en vaderlijke pronuclei nog niet heeft gefuseerd of in de S-fase is gekomen (figuur 2). Superovulatie wordt gebruikt om het aantal zygoten te maximaliseren, maar produceert zowel pronucleaire zygoten als onbevruchte eieren. Gezonde zygoten kunnen ook vooraf worden geselecteerd vóór elektroporatie om de algehele efficiëntie te verhogen. Aangezien andere elektroporatieprotocollen efficiënt bewerkte zygoten hebben zonder de noodzaak om een vergelijkbare stap 7,10,11,12,13,14,15 op te nemen, is een optionele stap van dit protocol de lichte erosie van de zona pellucida (ZP). De ZP is een glycoproteïnelaag die spermatozoabinding, acrosoomrespons en bevruchting rond embryo’s in het pronucleaire stadium helpt. In onze ervaring ontdekten we dat een zachte op zuur gebaseerde erosie van de ZP een betrouwbare Cas9 RNP-elektroporatieafgifte biedt met slechts een marginale impact op de levensvatbaarheid.
We hebben RNP-toedieningspercentages tot 100% efficiëntie waargenomen via elektroporatie in muizenstammen die vaak worden gebruikt in onderzoek zoals C57BL / 6J en C57BL / 6N 9,16. Onafhankelijke groepen hebben ook op elektroporatie gebaseerde procedures ontwikkeld met efficiënties groter dan of overeenkomend met micro-injectie 11,12,13,14,15,17, waarbij elektroporatieprotocollen goed functioneren bij rat 18,19, varken 20,21,22 en koe 23 , dus we raden lezers aan de protocollen te vergelijken om de omstandigheden te vinden die het beste passen bij hun experimentele en apparatuurbehoeften. Het hier beschreven systeem maakt gebruik van gemeenschappelijke materialen en apparatuur, waarvoor alleen elementaire embryomanipulatievaardigheden nodig zijn. Deze techniek is effectief voor een reeks bewerkingsstrategieën, waardoor deze methode breed toegankelijk is voor de onderzoeksgemeenschap.
Het ontwerpen van ideale kleine gids-RNA’s (sgRNA’s) is essentieel voor efficiënte bewerking. We raden aan om twee tot drie sgRNA-strategieën per doellocatie direct in muizenembryo’s te screenen, vooral als het genereren van muizenlijnen gewenst is. Eenmaal ontworpen, worden kloonvrije methoden zoals in vitro transcriptie (IVT) aanbevolen om hoogwaardige sgRNA’s te produceren3. De RRP’s en sgRNA’s worden gemengd met 30-50 verwerkte embryo’s in het pronucleaire stadium en blootgesteld aan een reeks elektrische pulsen om eerst tijdelijk het ZP- en celmembraan te doordringen, met daaropvolgende pulsen om de poriën open te houden en de RRP’s door de zygote24 te elektroforeren. Na optimalisatie ontdekten we dat zes pulsen van 3 ms bij 30 V voor bulkembryo’s (~ 50) optimaal waren voor het bewerken van effectiviteit en levensvatbaarheid, waardoor zeer efficiënte Cas9 / sgRNA RNP-afgifte 9,16,25 werd geboden. Bewerkingsgebeurtenissen in individuele muismorula kunnen worden bevestigd met behulp van een verscheidenheid aan validatiestrategieën die gebruikelijk zijn voor CRISPR-bewerking, zoals restrictief fragmentlengtepolymorfisme (RFLP), T7-endonucleasevertering en Sanger-sequencing van het interessegebied26.
De huidige methode is het meest geschikt voor eenvoudige bewerkingsschema’s (figuur 3), zoals insertie/deleties (indels), exon-formaat deleties in de orde van 500-2000 bp, en de levering van puntmutaties en kleine inserties zoals C- of N-Terminal-tags (bijv. FLAG, HA of V5)9,16,27. Het potentieel voor complexe genoombewerking, zoals grote inserties van fluorescerende tags of voorwaardelijke allelen, blijft onzeker en is de huidige focus van aankomende verbeteringen.
Deze methode is gemakkelijk onder de knie te krijgen en kan worden gebruikt om sgRNA’s snel te testen in gekweekte muizenembryo’s in 1 week9 (figuur 1). Gepresenteerd in dit werk is een zesstappenprotocol, dat 1) sgRNA-ontwerp omvat; 2) sgRNA-synthese; 3) superovulatie en paring; 4) embryocultuur, -verzameling en -verwerking; 5) RNP-assemblage en elektroporatie; 6) embryocultuur en genotypering. Informatie over alle gebruikte materialen wordt verstrekt (Tabel van materialen). Als positieve controle zijn reagentia voor het bewerken van de Tyrosinase (Tyr) locus 9,16 opgenomen in de aanvullende tabel 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een eenvoudige en zeer efficiënte technologie voor het bewerken van het muizengenoom gepresenteerd. Elektroporatie kan worden gebruikt om gemodificeerde embryo’s te genereren in 1-2 weken (figuur 1) en kan binnen 6 weken bewerkte muizen produceren9. Vergeleken met gelijktijdig ontwikkelde op elektroporatie gebaseerde protocollen die RNPs 7,10,11,12,13,14,15,17,32<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.J.M. creëerde het oorspronkelijke concept dat leidde tot de ontwikkeling van CRISPR-EZ en produceerde de figuren. C.K.D. stelde de interne en gepubliceerde protocollen voor dit huidige manuscript samen en bewerkte deze. A.J.M. wordt ondersteund door NIH (R00HD096108).
Materials
| 0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
| 26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
| 3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
| 35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
| 60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
| 6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
| BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
| Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
| DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
| DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
| EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
| EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
| Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
| Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
| Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
| Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
| HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
| HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
| Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
| Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
| KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
| LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
| Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
| Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
| Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
| Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
| High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
| Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
| Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
| Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
| RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
| Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
| Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
| Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
- Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
- Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
- Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
- Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
- Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
- Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
- Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
- Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
- Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
- Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
