تحرير الجينوم الفعال للفئران بواسطة كريسبر التثقيب الكهربائي للزيجوت
Summary
هنا ، نصف تقنية بسيطة مخصصة للتوليد الفعال للفئران المعدلة وراثيا تسمى CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). توفر هذه الطريقة كواشف التحرير عن طريق التثقيب الكهربائي في الأجنة بكفاءة تقترب من 100٪. هذا البروتوكول فعال للطفرات النقطية ، والإدخالات الجينومية الصغيرة ، والحذف في أجنة الثدييات.
Abstract
بفضل الكفاءة والدقة والسهولة الاستثنائية ، قام نظام CRISPR / Cas9 بتحسين تحرير الجينوم بشكل كبير في زراعة الخلايا والتجارب المعملية على الحيوانات. عند توليد نماذج حيوانية ، يوفر التثقيب الكهربائي للزيجوت كفاءة أعلى وبساطة وتكلفة وإنتاجية كبديل للطريقة القياسية الذهبية للحقن المجهري. التثقيب الكهربائي ألطف أيضا ، مع قابلية أعلى للحياة ، ويوفر بشكل موثوق Cas9 / أحادي التوجيه RNA (sgRNA) البروتينات النووية الريبية (RNPs) في زيجوت سلالات الفئران المختبرية الشائعة (على سبيل المثال ، C57BL / 6J و C57BL / 6N) التي تقترب من كفاءة التوصيل بنسبة 100٪. تتيح هذه التقنية طفرات الإدراج / الحذف (indels) ، والطفرات النقطية ، وحذف الجينات الكاملة أو الإكسونات ، والإدخالات الصغيرة في نطاق 100-200 نقطة أساس لإدراج LoxP أو العلامات القصيرة مثل FLAG أو HA أو V5. بينما يتم تحسينها باستمرار ، نقدم هنا الحالة الحالية ل CRISPR-EZ في بروتوكول يتضمن إنتاج sgRNA من خلال النسخ في المختبر ، ومعالجة الأجنة ، وتجميع RNP ، والتثقيب الكهربائي ، والتنميط الجيني للأجنة قبل الزرع. يمكن للباحث على مستوى الدراسات العليا مع الحد الأدنى من الخبرة في التعامل مع الأجنة الحصول على الأجنة المعدلة وراثيا في أقل من 1 أسبوع باستخدام هذا البروتوكول. هنا ، نقدم طريقة مباشرة ومنخفضة التكلفة وفعالة وعالية السعة يمكن استخدامها مع أجنة الفئران.
Introduction
تم تبسيط تحرير الجينوم في الفئران الحية إلى حد كبير وأصبح متاحا وبأسعار معقولة منذ ظهور تحرير كريسبر1،2،3. استخدمت محاولات التحرير الأولية للحيوانات الحقن المجهري لتوصيل كريسبر Cas9 mRNA / sgRNA إلى أجنة في المرحلة النووية4،5،6. في حين أن الحقن المجهري فعال للغاية ، فإن مقدار الممارسة المطلوبة لإتقانه بالكامل قد لا يكون مناسبا للمتدربين والطلاب ويتطلب أيضا معدات باهظة الثمن لا يستطيع المختبر الممول بشكل متواضع تحملها. عادة ما يتم إجراء الحقن المجهري من قبل فنيين خبراء في مرافق معدلة وراثيا مع جداول زمنية وأسعار خدمة تحدد المعدل للعديد من الباحثين. وهناك نهج أكثر سهولة هو نهج التثقيب الكهربائي ، والذي ثبت أنه فعال للغاية لتوصيل كريسبر Cas9 mRNA / sgRNA إلى أجنة في المرحلة النووية7. اقترحت التحسينات الإضافية في استراتيجيات تحرير وتسليم جينوم كريسبر أن RNPs المجمعة مسبقا والتي تعمل بالفعل مع sgRNAs قد تكون وسيلة فعالة لتقليل الفسيفساء8.
كان الأساس المنطقي وراء تطوير واستخدام هذا البروتوكول هو تجاوز العديد من القيود والعقبات المرتبطة بالحقن المجهري. كما يوحي الاسم ، فإن الطريقة السهلة والداخلية والفعالة من حيث التكلفة والتي يمكن أن تحدد بسرعة ما إذا كانت تصميمات sgRNA غير المختبرة ستكون جديرة بالاستخدام أثناء تجربة الحقن المجهري ستكون خطوة مراقبة جودة المرور الأولى مريحة للغاية (الشكل 1). في حين أن هذه الطريقة لا يمكن أن تحل محل الحقن المجهري لاستراتيجيات أكثر تعقيدا ، مثل إدخال تسلسلات الحمض النووي للمتبرع الطويل للنتائج القائمة على إعادة التركيب ، إلا أنها مثالية للاستراتيجيات الأقل تعقيدا مثل عمليات الحذف أو الإدراج الصغيرة ووضع علامات على الجينات. هذه الطريقة مناسبة للباحثين ذوي المهارات الأساسية لمعالجة الأجنة الذين لديهم احتياجات تحرير بسيطة ، أو يرغبون في اختبار فرضيتهم ضمن الإطار الزمني لتطوير ما قبل الزرع ، أو يفضلون اختبار sgRNAs في الأجنة قبل تحديد موعد مع أخصائي الحقن المجهري. هنا ، يتم تسليم كواشف التحرير بشكل عابر إلى أجنة في المرحلة النووية مثل Cas9 / sgRNA RNPs عبر التثقيب الكهربائي (سلسلة من النبضات الكهربائية) لزيادة الكفاءة إلى أقصى حد مع تقليل الفسيفساء8. باستخدام طريقة التنميط الجيني للجنين ، تتوفر نتائج التحرير في حوالي 1 أسبوع9 ، مما يقلل من الحاجة إلى تطبيقات الحقن المجهري المختلفة بتكلفة منخفضة بشكل كبير.
تبلغ فعالية هذه الطريقة ذروتها في مرحلة الجنين الطليعي النواة ، عندما لا يكون الجنين قد دمج بعد نوى الأم والأب أو دخل المرحلة S (الشكل 2). يستخدم التبويض الفائق لزيادة عدد الزيجوتات إلى أقصى حد، ولكنه ينتج كلا من الزيجوت الطليعي النووي والبيض غير المخصب. يمكن أيضا اختيار الزيجوت الصحي مسبقا قبل التثقيب الكهربائي لزيادة الكفاءة الكلية. نظرا لأن بروتوكولات التثقيب الكهربائي الأخرى قد حررت الزيجوت بكفاءة دون الحاجة إلى تضمين خطوة مماثلة7،10،11،12،13،14،15 ، فإن الخطوة الاختيارية لهذا البروتوكول هي التآكل الطفيف للمنطقة الشفافة (ZP). ZP عبارة عن طبقة بروتين سكري تساعد على ربط الحيوانات المنوية ، واستجابة الجسيم القمي ، والإخصاب المحيط بالأجنة في المرحلة الأولية. في تجربتنا ، وجدنا أن التآكل اللطيف القائم على الحمض ل ZP يوفر توصيلا موثوقا به للثقب الكهربائي Cas9 RNP مع تأثير هامشي فقط على الجدوى.
لقد لاحظنا معدلات توصيل RNP بكفاءة تصل إلى 100٪ عن طريق التثقيب الكهربائي في سلالات الماوس التي يشيع استخدامها في أبحاث مثل C57BL / 6J و C57BL / 6N 9,16. طورت مجموعات مستقلة أيضا إجراءات قائمة على التثقيب الكهربائي بكفاءة أكبر من أو مطابقة الحقن المجهري 11،12،13،14،15،17 ، مع بروتوكولات التثقيب الكهربائي التي تعمل بشكل جيد في الفئران18،19 ، الخنزير 20،21،22 والبقرة 23 ، لذلك نقترح أن يقارن القراء البروتوكولات للعثور على الظروف التي تناسب احتياجاتهم التجريبية والمعدات. يستخدم النظام الموصوف هنا مواد ومعدات شائعة ، ولا يتطلب سوى مهارات التلاعب بالأجنة الأساسية. هذه التقنية فعالة لمجموعة من استراتيجيات التحرير ، مما يجعل هذه الطريقة متاحة على نطاق واسع لمجتمع البحث.
يعد تصميم دليل RNAs الصغير المثالي (sgRNAs) أمرا ضروريا للتحرير الفعال. نوصي بفحص اثنين إلى ثلاثة استراتيجيات sgRNA لكل موقع مستهدف مباشرة في أجنة الفئران ، خاصة إذا كان إنشاء خط الماوس مطلوبا. بمجرد التصميم ، يوصى باستخدام طرق خالية من الاستنساخ مثل النسخ في المختبر (IVT) لإنتاج sgRNAs عالية الجودة3. يتم خلط RNPs و sgRNAs مع 30-50 أجنة في المرحلة النووية المعالجة وتتعرض لسلسلة من النبضات الكهربائية لاختراق ZP وغشاء الخلية مؤقتا أولا ، مع نبضات لاحقة لإبقاء المسام مفتوحة والكهربائي RNPs من خلال الزيجوت24. بعد التحسين ، وجدنا أن ست نبضات 3 مللي ثانية عند 30 فولت للأجنة السائبة (~ 50) كانت مثالية لتحرير الفعالية والجدوى ، مما يوفر توصيل Cas9 / sgRNA RNP عالي الكفاءة9،16،25. يمكن تأكيد أحداث التحرير في توتية الماوس الفردية باستخدام مجموعة متنوعة من استراتيجيات التحقق الشائعة لتحرير كريسبر ، مثل تعدد الأشكال لطول شظية التقييد (RFLP) ، وهضم نوكلياز T7 ، وتسلسل سانجر لمنطقة الاهتمام26.
الطريقة الحالية هي الأنسب لمخططات التحرير البسيطة (الشكل 3) ، مثل الإدراج / الحذف (indels) ، وعمليات الحذف ذات الحجم الخارجي بترتيب 500-2000 نقطة أساس ، وتسليم طفرات النقاط والإدخالات الصغيرة مثل علامات C- أو N-Terminal (على سبيل المثال ، FLAG أو HA أو V5) 9،16،27. لا تزال إمكانية تحرير الجينوم المعقد ، مثل الإدخالات الكبيرة لعلامات الفلورسنت أو الأليلات الشرطية ، غير مؤكدة وهي محور التركيز الحالي للتحسينات القادمة.
يمكن إتقان هذه الطريقة بسهولة ويمكن استخدامها لاختبار sgRNAs بسرعة في أجنة الفئران المستزرعة في أسبوع واحد9 (الشكل 1). يقدم في هذا العمل بروتوكول من ست خطوات ، والذي يتضمن 1) تصميم sgRNA. 2) توليف sgRNA. 3) الإباضة والتزاوج. 4) زراعة الأجنة وجمعها ومعالجتها ؛ 5) تجميع RNP والتثقيب الكهربائي ؛ 6) زراعة الأجنة والتنميط الجيني. يتم توفير معلومات حول جميع المواد المستخدمة (جدول المواد). كعنصر تحكم إيجابي ، تم تضمين الكواشف لتحرير موضع التيروزيناز (صور)9،16 في الجدول التكميلي 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
تظهر هنا تقنية تحرير جينوم الماوس المباشرة وعالية الكفاءة. يمكن استخدام التثقيب الكهربائي لتوليد أجنة معدلة في 1-2 أسابيع (الشكل 1) ويمكن أن ينتج فئرانا معدلة في غضون 6 أسابيع9. بالمقارنة مع البروتوكولات القائمة على التثقيب الكهربائي المطورة بشكل معاصر والتي تو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ابتكرت A.J.M. المفهوم الأصلي الذي أدى إلى تطوير CRISPR-EZ وأنتجت الأشكال. قام C.K.D. بتجميع وتكييف البروتوكولات الداخلية والمنشورة لهذه المخطوطة الحالية. A.J.M. مدعوم من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R00HD096108).
Materials
| 0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
| 26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
| 3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
| 35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
| 60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
| 6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
| BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
| Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
| DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
| DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
| EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
| EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
| Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
| Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
| Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
| Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
| HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
| HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
| Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
| Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
| KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
| LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
| Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
| Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
| Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
| Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
| High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
| Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
| Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
| Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
| RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
| Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
| Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
| Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
- Wang, B., et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques. 59 (4), 201-208 (2015).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature Protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Fujii, W., Onuma, A., Sugiura, K., Naito, K. One-step generation of phenotype-expressing triple-knockout mice with heritable mutated alleles by the CRISPR/Cas9 system. Journal of Reproduction and Development. 60 (4), 324-327 (2014).
- Kaneko, T., et al. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
- Modzelewski, A. J., et al. Efficient mouse genome engineering by CRISPR-EZ technology. Nature Protocols. 13 (6), 1253-1274 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nature Protocols. 14 (8), 2452-2482 (2019).
- Hur, J. K., et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nature Biotechnology. 34 (8), 807-808 (2016).
- Tröder, S. E., et al. An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes. PLoS One. 13 (5), 0196891 (2018).
- Qin, W., et al. Efficient CRISPR/cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease. Genetics. 200 (2), 423-430 (2015).
- Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse. Developmental Biology. 418 (1), 1-9 (2016).
- Teixeira, M., et al. Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing. Scientific Reports. 8, 474 (2018).
- Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -. F., Modzelewski, A. J., He, L. Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes. Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).
- Wang, W., et al. Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation. Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Remy, S., et al. Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation. Scientific Reports. 7, 16554 (2017).
- Tanihara, F., et al. Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation. Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).
- Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes. Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).
- Nishio, K., et al. Effects of voltage strength during electroporation on the development and quality of in vitro-produced porcine embryos. Reproduction in Domestic Animals. 53 (2), 313-318 (2018).
- Camargo, L. S. A., Owen, J. R., van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos. Frontiers in Genetics. 11, 570069 (2020).
- Escoffre, J. M., et al. What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues. Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).
- Chen, S., et al. CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection. Cell Reports. 27 (13), 3780-3789 (2019).
- Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Scientific Reports. 8, 888 (2018).
- Modzelewski, A. J., et al. A mouse-specific retrotransposon drives a conserved Cdk2ap1 isoform essential for development. Cell. 184 (22), 5541-5558 (2021).
- Xu, H., et al. Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design. Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs. Scientific Reports. 9, 14811 (2019).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. Journal of Visualized Experiments. (3), e185 (2007).
- Takahashi, G., et al. GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice. Scientific Reports. 5, 11406 (2015).
- Tu, Z., et al. Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos. Scientific Reports. 7, 42081 (2017).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16 (1), 87 (2015).
- Zhu, L., et al. Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes. BMC Genomics. 10, 47 (2009).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18, 92 (2017).
- Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. Designing and generating a mouse model: frequently asked questions. Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).
- Nakajima, K., et al. Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system. Scientific Reports. 6, 34703 (2016).
- Iyer, V., et al. Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice. Nature Methods. 12 (6), 479 (2015).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
