Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos
Summary
Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.
Abstract
Con una eficiencia, precisión y facilidad excepcionales, el sistema CRISPR / Cas9 ha mejorado significativamente la edición del genoma en cultivos celulares y experimentos con animales de laboratorio. Al generar modelos animales, la electroporación de cigotos ofrece una mayor eficiencia, simplicidad, costo y rendimiento como alternativa al método estándar de microinyección. La electroporación también es más suave, con mayor viabilidad, y suministra de manera confiable ribonucleoproteínas (RNP) Cas9 / ARN de guía única (sgRNA) en los cigotos de cepas comunes de ratones de laboratorio (por ejemplo, C57BL / 6J y C57BL / 6N) que se acerca al 100% de eficiencia de entrega. Esta técnica permite mutaciones de inserción/deleción (indeles), mutaciones puntuales, la deleción de genes enteros o exones, e inserciones pequeñas en el rango de 100-200 pb para insertar LoxP o etiquetas cortas como FLAG, HA o V5. Aunque se mejora constantemente, aquí presentamos el estado actual de CRISPR-EZ en un protocolo que incluye la producción de sgRNA a través de la transcripción in vitro , el procesamiento de embriones, el ensamblaje de RNP, la electroporación y el genotipado de embriones preimplantacionales. Un investigador de posgrado con experiencia mínima en la manipulación de embriones puede obtener embriones genéticamente editados en menos de 1 semana utilizando este protocolo. Aquí, ofrecemos un método sencillo, de bajo costo, eficiente y de alta capacidad que podría usarse con embriones de ratón.
Introduction
La edición del genoma en ratones vivos se ha simplificado considerablemente y se ha vuelto accesible y más asequible desde la aparición de la edición CRISPR 1,2,3. Los intentos iniciales de edición en animales utilizaron microinyección para administrar ARNm/sgRNA de CRISPR Cas9 en embriones en estadio pronuclear 4,5,6. Si bien la microinyección es bastante efectiva, la cantidad de práctica requerida para dominarla completamente podría no ser apropiada para aprendices y estudiantes y también requiere equipos costosos que un laboratorio modestamente financiado no puede pagar. La microinyección normalmente es realizada por técnicos expertos en instalaciones transgénicas con horarios y precios de servicio que limitan la velocidad para muchos investigadores. Un enfoque más accesible es el de la electroporación, que ha demostrado ser bastante eficaz para la entrega de ARNm/sgRNA de CRISPR Cas9 en embriones en estadio pronuclear7. Otras mejoras en las estrategias de edición y entrega del genoma CRISPR sugirieron que las RNP preensambladas que ya están comprometidas con sgRNAs pueden ser un medio eficaz para reducir el mosaicismo8.
La razón detrás del desarrollo y uso de este protocolo fue evitar muchas de las limitaciones y obstáculos asociados con la microinyección. Como su nombre lo indica, un método fácil, interno y rentable que pudiera determinar rápidamente si valdría la pena usar diseños de sgRNA no probados durante un experimento de microinyección sería un paso de control de calidad de primer paso muy conveniente (Figura 1). Si bien este método no puede reemplazar la microinyección para estrategias más complejas, como la introducción de secuencias largas de ADN del donante para resultados basados en la recombinación, es ideal para estrategias menos complejas como pequeñas deleciones o inserciones y etiquetado de genes. Este método es apropiado para investigadores con habilidades básicas de manipulación de embriones que tienen necesidades de edición simples, les gustaría probar su hipótesis dentro del marco de tiempo del desarrollo preimplantacional, o prefieren probar sgRNAs en embriones antes de programar una cita con un especialista en microinyección. Aquí, los reactivos de edición se administran transitoriamente en embriones en etapa pronuclear como RNP Cas9 / sgRNA a través de electroporación (una serie de pulsos eléctricos) para maximizar la eficiencia y disminuir el mosaicismo8. Utilizando un método de genotipado de embriones, los resultados de edición están disponibles en aproximadamente 1 semana9, lo que reduce la necesidad de varias aplicaciones de microinyección a un costo significativamente reducido.
La efectividad de este método alcanza su punto máximo en la etapa embrionaria pronuclear, cuando el embrión aún no ha fusionado los pronúcleos materno y paterno o no ha entrado en fase S (Figura 2). La superovulación se utiliza para maximizar el número de cigotos, pero produce cigotos pronucleares y óvulos no fertilizados. Los cigotos sanos también se pueden preseleccionar antes de la electroporación para aumentar la eficiencia general. Como otros protocolos de electroporación han editado eficientemente cigotos sin necesidad de incluir un paso similar 7,10,11,12,13,14,15, un paso opcional de este protocolo es la ligera erosión de la zona pelúcida (ZP). La ZP es una capa de glicoproteína que ayuda a la unión de los espermatozoides, la respuesta acrosómica y la fertilización que rodea a los embriones en etapa pronuclear. En nuestra experiencia, encontramos que una suave erosión a base de ácido de la ZP proporciona una entrega confiable de electroporación Cas9 RNP con solo un impacto marginal en la viabilidad.
Hemos observado tasas de entrega de RNP de hasta 100% de eficiencia a través de electroporación en cepas de ratón que se utilizan comúnmente en investigaciones como C57BL / 6J y C57BL / 6N 9,16. Grupos independientes también han desarrollado procedimientos basados en electroporación con eficiencias mayores o equivalentes a la microinyección 11,12,13,14,15,17, con protocolos de electroporación que funcionan bien en rata18,19, cerdo 20,21,22 y vaca 23 , por lo que sugerimos que los lectores comparen los protocolos para encontrar las condiciones que mejor se adapten a sus necesidades experimentales y de equipo. El sistema descrito aquí utiliza materiales y equipos comunes, que requieren solo habilidades básicas de manipulación de embriones. Esta técnica es efectiva para una variedad de estrategias de edición, lo que hace que este método sea ampliamente accesible para la comunidad de investigación.
El diseño de ARN guía pequeños ideales (sgRNAs) es esencial para una edición eficiente. Recomendamos cribar de dos a tres estrategias de sgRNA por sitio objetivo directamente en embriones de ratón, especialmente si se desea la generación de línea de ratón. Una vez diseñados, se recomiendan métodos libres de clonación como la transcripción in vitro (IVT) para producir sgRNAs de alta calidad3. Los RNPs y sgRNAs se mezclan con 30-50 embriones procesados en estadio pronuclear y se exponen a una serie de pulsos eléctricos para permeabilizar primero temporalmente la ZP y la membrana celular, con pulsos posteriores para mantener los poros abiertos y electrophorese los RNPs a través del cigoto24. Después de la optimización, encontramos que seis pulsos de 3 ms a 30 V para embriones a granel (~ 50) fueron óptimos para la efectividad y viabilidad de la edición, proporcionando una entrega de Cas9 / sgRNA RNP altamente eficiente 9,16,25. Los eventos de edición en mórulas individuales de ratón pueden confirmarse utilizando una variedad de estrategias de validación comunes para la edición CRISPR, como el polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP), la digestión de endonucleasas T7 y la secuenciación de Sanger de la región de interés26.
El método actual es más apropiado para esquemas de edición simples (Figura 3), como inserciones/deleciones (indeles), deleciones de tamaño de exón del orden de 500-2000 pb, y la entrega de mutaciones puntuales e inserciones pequeñas como etiquetas C- o N-Terminal (por ejemplo, FLAG, HA o V5)9,16,27. El potencial para la edición compleja del genoma, como grandes inserciones de etiquetas fluorescentes o alelos condicionales, sigue siendo incierto y es el foco actual de las próximas mejoras.
Este método se domina fácilmente y se puede utilizar para probar rápidamente sgRNAs en embriones de ratón cultivados en 1 semana9 (Figura 1). En este trabajo se presenta un protocolo de seis pasos, que incluye 1) diseño de sgRNA; 2) síntesis de sgRNA; 3) superovulación y apareamiento; 4) cultivo, recolección y procesamiento de embriones; 5) montaje y electroporación de RNP; 6) cultivo embrionario y genotipado. Se proporciona información sobre todos los materiales utilizados (Tabla de materiales). Como control positivo, los reactivos para editar el locus 9,16 de la tirosinasa (Tyr) se han incluido en la Tabla suplementaria 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se presenta una tecnología de edición del genoma del ratón sencilla y altamente eficiente. La electroporación se puede utilizar para generar embriones modificados en 1-2 semanas (Figura 1) y puede producir ratones editados dentro de las 6 semanas9. En comparación con los protocolos basados en electroporación desarrollados contemporáneamente que entregan RNP 7,10,11,12,13,14,15,17,32, el método descrito aquí es conceptualmente similar y ofrece eficiencia…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A.J.M. creó el concepto original que condujo al desarrollo de CRISPR-EZ y produjo las figuras. C.K.D. compiló y adaptó los protocolos internos y publicados para este manuscrito actual. A.J.M. es compatible con NIH (R00HD096108).
Materials
| 0.1-cm-gap electroporation cuvette | Bio-Rad | cat. no. 1652089 | Electroporation |
| 26-G, 1/2-inch needle | BD | cat. no. 305111 | Superovulation |
| 3–8-month-old male mice and 3- to 5-week-old female mice | JAX | cat. no. 000664 | Superovulation |
| 35-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 627-160 | Embryo Culture |
| 60-mm Tissue culture dish | Greiner Bio-One, | cat. no. 628-160 | Embryo Processing |
| 6x loading dye | Thermo Fisher Scientific | cat. no. R0611 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Acidic Tyrode's (AT) solution, embryo culture grade | Sigma-Aldrich, | cat. no. T1788 | Embryo Processing |
| BSA, embryo culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. A3311 | Embryo Processing and Culture |
| Cas9 protein | Alt-R S.p. Cas9 nuclease 3NLS | cat. no. 1074181 | Electroporation |
| DNase I, RNase-free | New England BioLabs, | cat. no. M0303 | sgRNA Synthesis |
| DPBS(calcium and magnesium free) | Gibco | cat. no. 14190-144 | Embryo Processing |
| EcoRI | NEB | cat. no. R3101S | Genotyping |
| EDTA, anhydrous | Sigma-Aldrich | cat. no. EDS-100G | RNP Buffer |
| Ethanol | Koptec | cat. no. V1016 | sgRNA Synthesis |
| Gelatin (powder) type B, laboratory grade | Fisher, | cat. no. G7-500 | Lysis Buffer |
| Glycerol, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP229 | RNP Buffer |
| Taq Polymerase | Promega | cat. no. M712 | Genotyping |
| HEPES, cell culture grade | Sigma-Aldrich | cat. no. H4034 | RNP Buffer |
| HinfI (10,000 U/mL) | NEB | cat. no. R0155S | Genotyping |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs, | cat. no. E2040 | sgRNA Synthesis |
| Human chorion gonadotropin, lyophilized (hCG) | Millipore | cat. no. 230734 | Superovulation |
| Hyaluronidase/M2 | Millipore | cat. no. MR-051-F | Embryo Processing |
| KSOMaa Evolve medium (potassium-supplemented simplex-optimized medium plus amino acids) | Zenith Biotech | cat. no. ZEKS-050 | Embryo Culture |
| LE agarose, analytical grade | BioExpress | cat. no. E-3120-500 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| M2 medium | Zenith Biotech | cat. no. ZFM2-050 | Embryo Processing |
| Magnesium chloride, anhydrous (MgCl2) | Sigma-Aldrich | cat. no. M8266 | RNP and Lysis Buffer |
| Mineral Oil | Millipore | cat. no. ES-005C | Embryo Culture |
| Nonidet P-40,substitute (NP-40) | Sigma-Aldrich | cat. no. 74385 | Lysis Buffer |
| Nuclease-free water, molecular-biology grade | Ambion | cat. no. AM9937 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Oligos for sgRNA synthesis, donor oligo and PCR primers for genotyping | Integrated DNA Technologies | custom orders | sgRNA Design |
| Reduced serum medium | Thermo Fisher Scientific | cat. no. 31985062 | Embryo Culture |
| High-fidelity DNA polymerase | New England BioLabs, | cat. no. M0530 | sgRNA Synthesis |
| Potassium chloridemolecular-biology grade (KCl) | Sigma-Aldrich | cat. no. P9333 | RNP and Lysis Buffer |
| Pregnant mare serum gonadotropin lyophilizd ((PMSG) | ProspecBio | cat. no. HOR-272 | Superovulation |
| Proteinase K, molecular-biology grade | Fisher | cat. no. BP1700-100 | Lysis Buffer |
| RNase-free 1.5-mL microcentrifuge tube | VWR | cat. no. 20170-333 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| RNase-free eight-well PCR strip tubes | VWR | cat. no. 82006-606 | sgRNA Synthesis and Genotyping |
| Magnetic purification beads | GE Healthcare | cat. no. 65152105050250 | sgRNA Synthesis |
| Tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | cat. no. C4706 | RNP Buffer |
| Tris-HCl solution, pH 8.5 molecular-biology grade | Teknova | cat. no. T1085 | Lysis Buffer |
| Tween 20 molecular-biology grade | Sigma-Aldrich | cat. no. P7949-500 | Lysis Buffer |
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