Effiziente Genom-Editierung von Mäusen durch CRISPR-Elektroporation von Zygoten

Die Genom-Editierung bei lebenden Mäusen wurde erheblich vereinfacht und ist seit dem Aufkommen der CRISPR-Editierung^{zugänglicher} und erschwinglicher geworden ^1,2,3. Erste Versuche zur Bearbeitung von Tieren verwendeten Mikroinjektionen, um CRISPR Cas9 mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium zu liefern ^4,5,6. Während die Mikroinjektion sehr effektiv ist, ist die Menge an Übung, die erforderlich ist, um sie vollständig zu beherrschen, möglicherweise nicht für Auszubildende und Studenten geeignet und erfordert auch teure Geräte, die sich ein bescheiden finanziertes Labor nicht leisten kann. Die Mikroinjektion wird in der Regel von erfahrenen Technikern in transgenen Anlagen mit Zeitplänen und Servicepreisen durchgeführt, die für viele Forscher preisbegrenzend sind. Ein zugänglicherer Ansatz ist die Elektroporation, die sich als sehr effektiv für die Verabreichung von CRISPR-Cas9-mRNA / sgRNA in Embryonen im Pronuklearstadium erwiesen hat⁷. Weitere Verbesserungen bei der Genom-Editierung und den Verabreichungsstrategien von CRISPR deuten darauf hin, dass vorkonfektionierte RNPs, die bereits mit sgRNAs verbunden sind, ein wirksames Mittel zur Verringerung des Mosaizismus sein könnten⁸.

Der Grund für die Entwicklung und Verwendung dieses Protokolls bestand darin, viele der Einschränkungen und Hindernisse zu umgehen, die mit der Mikroinjektion verbunden sind. Wie der Name schon sagt, wäre eine einfache, hauseigene und kostengünstige Methode, mit der schnell festgestellt werden kann, ob sich ungetestete sgRNA-Designs während eines Mikroinjektionsexperiments lohnen, ein sehr praktischer Schritt zur Qualitätskontrolle im ersten Durchgang (Abbildung 1). Während diese Methode die Mikroinjektion für komplexere Strategien, wie die Einführung langer Spender-DNA-Sequenzen für rekombinationsbasierte Ergebnisse, nicht ersetzen kann, ist sie ideal für weniger komplexe Strategien wie kleine Deletionen oder Insertionen und die Markierung von Genen. Diese Methode eignet sich für Forscher mit grundlegenden Fähigkeiten in der Manipulation von Embryonen, die einfache Bearbeitungsbedürfnisse haben, ihre Hypothese innerhalb des Zeitrahmens der Präimplantationsentwicklung testen möchten oder es vorziehen, sgRNAs in Embryonen zu testen, bevor sie einen Termin mit einem Mikroinjektionsspezialisten vereinbaren. Hier werden Editierreagenzien vorübergehend als Cas9 / sgRNA-RNPs über Elektroporation (eine Reihe elektrischer Impulse) in Embryonen im pronuklearen Stadium eingebracht, um die Effizienz zu maximieren und gleichzeitig den Mosaikismus zu verringern⁸. Unter Verwendung einer Embryonen-Genotypisierungsmethode liegen die Bearbeitungsergebnisse in ca. 1 Woche⁹ vor, wodurch der Bedarf an verschiedenen Mikroinjektionsanwendungen zu deutlich reduzierten Kosten reduziert wird.

Die Wirksamkeit dieser Methode erreicht ihren Höhepunkt im pronukleären Embryostadium, wenn der Embryo noch nicht mit den mütterlichen und väterlichen Vorkernen verschmolzen ist oder in die S-Phase eingetreten ist (Abbildung 2). Superovulation wird verwendet, um die Anzahl der Zygoten zu maximieren, produziert aber sowohl pronukleäre Zygoten als auch unbefruchtete Eier. Gesunde Zygoten können auch vor der Elektroporation vorselektiert werden, um die Gesamteffizienz zu erhöhen. Da andere Elektroporationsprotokolle Zygoten effizient editiert haben, ohne dass ein ähnlicher Schritt 7,10,11,12,13,14,15 erforderlich ist^, ist ein optionaler Schritt dieses Protokolls die leichte Erosion der Zona pellucida (ZP). Das ZP ist eine Glykoproteinschicht, die die Bindung von Spermatozoen, die Akrosomenreaktion und die Befruchtung von Embryonen im Pronuklearstadium unterstützt. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass eine sanfte säurebasierte Erosion des ZP eine zuverlässige Cas9-RNP-Elektroporation mit nur marginalen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit bietet.

Wir haben RNP-Lieferraten von bis zu 100% Effizienz durch Elektroporation in Mausstämmen beobachtet, die häufig in der Forschung verwendet werden, wie C57BL / 6J und C57BL / 6N ^9,16. Unabhängige Gruppen haben auch auf Elektroporation basierende Verfahren entwickelt, deren Wirkungsgrade größer oder gleich denen der Mikroinjektion 11, 12, 13, ^{14, 15}, 17 sind, wobei die Elektroporationsprotokolle bei Ratten¹⁸, ¹⁹, Schweinen 20,^{21, 22} und Kühen ²³ gut funktionieren Daher empfehlen wir den Lesern, die Protokolle zu vergleichen, um die Bedingungen zu finden, die ihren Experimentier- und Ausrüstungsanforderungen am besten entsprechen. Das hier beschriebene System verwendet gängige Materialien und Geräte, die nur grundlegende Fähigkeiten zur Manipulation von Embryonen erfordern. Diese Technik ist für eine Reihe von Bearbeitungsstrategien wirksam und macht diese Methode für die Forschungsgemeinschaft allgemein zugänglich.

Das Design idealer Small-Guide-RNAs (sgRNAs) ist für eine effiziente Bearbeitung unerlässlich. Wir empfehlen, zwei bis drei sgRNA-Strategien pro Zielort direkt in Mausembryonen zu screenen, insbesondere wenn die Generierung von Mauslinien gewünscht wird. Einmal entwickelt, werden klonenfreie Methoden wie die In-vitro-Transkription (IVT) zur Herstellung hochwertiger sgRNAs empfohlen³. Die RNPs und sgRNAs werden mit 30-50 prozessierten Embryonen im Pronuklearstadium gemischt und einer Reihe von elektrischen Impulsen ausgesetzt, um zuerst vorübergehend die ZP und die Zellmembran zu permeabilisieren, mit nachfolgenden Impulsen, um die Poren offen zu halten und die RNPs durch die Zygote²⁴ zu elektrophorisieren. Nach der Optimierung fanden wir heraus, dass sechs 3-ms-Impulse bei 30 V für Massenembryonen (~ 50) optimal für die Editiereffektivität und Lebensfähigkeit waren und eine hocheffiziente Cas9 / sgRNA-RNP-Lieferung ^9,16,25 ermöglichten. Editierereignisse in einzelnen Mausmorula können mit einer Vielzahl von Validierungsstrategien bestätigt werden, die für die CRISPR-Bearbeitung üblich sind, wie z. B. Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), T7-Endonuklease-Verdauung und Sanger-Sequenzierung der interessierenden Region²⁶.

Die aktuelle Methode eignet sich am besten für einfache Bearbeitungsschemata (Abbildung 3), wie z. B. Einfügungen/Löschungen (Indels), Exon-große Löschungen in der Größenordnung von 500-2000 bp und die Bereitstellung von Punktmutationen und kleinen Insertionen wie C- oder N-Terminal-Tags (z. B. FLAG, HA oder V5)^9,16,27. Das Potenzial für komplexe Genom-Editierung, wie große Insertionen von Fluoreszenz-Tags oder bedingten Allelen, bleibt ungewiss und steht derzeit im Fokus bevorstehender Verbesserungen.

Diese Methode ist leicht zu beherrschen und kann verwendet werden, um sgRNAs in kultivierten Mausembryonen in 1 Woche⁹ schnell zu testen (Abbildung 1). In dieser Arbeit wird ein sechsstufiges Protokoll vorgestellt, das 1) sgRNA-Design; 2) sgRNA-Synthese; 3) Superovulation und Paarung; 4) Embryonenkultur, -entnahme und -verarbeitung; 5) RNP-Montage und Elektroporation; 6) Embryokultur und Genotypisierung. Informationen über alle verwendeten Materialien werden zur Verfügung gestellt (Materialtabelle). Als Positivkontrolle wurden Reagenzien zur Bearbeitung des Tyrosinase (Tyr)-Locus ^9,16 in die Ergänzungstabelle 1 aufgenommen.