Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos
Summary
O presente protocolo descreve a microinjeção de zigoto de CRISPR-Cas9 e DNA do doador para produzir eficientemente camundongos knock-in e floxed de gênico.
Abstract
A tecnologia CRISPR-Cas permitiu a geração rápida e sem esforço de camundongos geneticamente modificados. Especificamente, camundongos e camundongos mutantes pontuais são prontamente produzidos por eletroporação de fatores CRISPR (e doadores de DNA oligo de fita simples) no zigoto. Em contraste, camundongos knock-in e floxed de gênico (>1 kb) são gerados principalmente por microinjeção de fatores CRISPR e doadores de DNA de fita dupla em zigotos. As tecnologias de edição do genoma também aumentaram a flexibilidade da produção de camundongos geneticamente modificados. Agora é possível introduzir as mutações pretendidas nas regiões genômicas alvo em várias cepas benéficas de camundongos. Nossa equipe produziu mais de 200 linhas de camundongos knock-in de genético e mais de 110 linhagens de camundongos floxados por microinjeção de zigoto de CRISPR-Cas9 após solicitações de vários países, incluindo o Japão. Algumas dessas edições de genoma usaram linhagens BALB/c, C3H/HeJ e C57BL/6N, porém a maioria usou cepas C57BL/6J. Ao contrário do método de eletroporação, a edição do genoma por microinjeção de zigoto em várias linhagens de camundongos não é tão fácil. No entanto, camundongos knock-in e floxed de genético em fundos genéticos endogâmicos únicos são tão críticos quanto modelos genéticos humanizados, fluorescentes e camundongos nocaute condicional. Portanto, este artigo apresenta o protocolo para a microinjeção de zigoto de fatores CRISPR e doadores de DNA de fita dupla em camundongos C57BL/6J para geração de camundongos knock-in e floxed de gênico. Este artigo enfoca exclusivamente a injeção nuclear em vez da injeção citoplasmática. Além da microinjeção de zigoto, delineamos o cronograma do processo de produção e técnicas periféricas, como indução de superovulação e transferência embrionária.
Introduction
Camundongos knock-in, nos quais os genes exógenos pretendidos são introduzidos nos loci alvo, são amplamente utilizados em muitos estudos in vivo como camundongos humanizados genes, camundongos repórteres fluorescentes e camundongos condutores Cre 1,2. Quando mutações knock-in são induzidas pela edição do genoma em zigotos de camundongos, DNA de fita simples (doadores de DNA oligo de fita simples, ssODN) ou DNA de fita dupla (dsDNA) é usado como DNA do doador 2,3. O ssODN é usado principalmente para knock-in de fragmentos gênicos relativamente curtos de menos de 200 pb4. É possível derrubar fragmentos com mais de 1 kb de DNA usando ssODNs longos (lsODN)5,6, porém sua preparação é demorada. Quando doadores de dsDNA são usados, camundongos knock-in de gênico (>1 kb) podem ser gerados sem a preparação trabalhosa do DNA do doador7.
A principal vantagem do uso de ssODNs é que a eletroporação8 pode gerar camundongos knock-in. No entanto, doadores de dsDNA devem ser introduzidos diretamente no núcleo por microinjeção de zigoto. O knock-in simultâneo em dois locais é necessário para criar camundongos floxados, nos quais cada sequência loxP é batida a montante e a jusante do gene alvo. Existem duas maneiras de gerar camundongos floxados por edição de genoma em zigotos de camundongos – usando dois ssODNs independentes, cada um carregando um único sítio loxP, ou usando um único dsDNA (ou lsDNA) com uma sequência floxed; o primeiro é muito ineficiente 9,10,11. A edição do genoma usando doadores de dsDNA é a abordagem mais simples para produzir camundongos knock-in e floxed de genético se o ambiente for propício à microinjeção de zigoto.
Inicialmente, misturas de mRNA de Cas9 e sgRNA ou vetores de DNA que codificam sgRNA e Cas9 são utilizadas para edição do genoma em zigotos de camundongos12,13. Uma vez que proteínas Cas9 estáveis e de alta qualidade estão agora disponíveis a um baixo custo, a introdução da ribonucleoproteína (RNP) crRNA-tracrRNA-Cas9 em zigotos de camundongos14 tornou-se popular. Recentemente, camundongos knock-in foram gerados com alta eficiência pela introdução do RNP crRNA-tracrRNA-Cas9 e DNA doador em ambos os pronúcleos de zigotos de camundongos em uma fase do ciclo celular em que o knock-in é mais provável de ocorrer15. Portanto, o presente protocolo descreve técnicas para a produção de vários tipos de camundongos knock-in por este método.
Existem muitas linhagens endogâmicas úteis de camundongos de laboratório16. A modificação genética dentro do fundo endogâmico pode desconsiderar a influência do background genético no fenótipo. Este artigo descreve um método para induzir mutações no gene knock-in e floxed no zigoto da linhagem de camundongos endogâmica mais comumente usada, a C57BL/6J17. Além disso, a linha do tempo para a geração de camundongos geneticamente modificados e as técnicas periféricas utilizadas também são discutidas, incluindo a indução de superovulação e transferência de embriões.
Protocol
Representative Results
Discussion
No presente estudo, zigotos frescos (não congelados) de camundongos C57BL/6J, obtidos de acasalamento natural, foram usados para edição do genoma de camundongos. Ao injetar crRNA-tracrRNA-Cas9 e DNA do doador (RNPD) em ambos os pronúcleos desses zigotos em uma fase do ciclo celular em que o knock-in é mais provável de ocorrer, camundongos knock-in e floxed foram gerados com uma alta taxa de natalidade e eficiência suficiente de edição do genoma. O presente estudo fortalece a extensibilidade do método SPRINT-CRISPR15, onde garante eficiência suficiente de knock-in mesmo no background genético C57BL/6J, e pode ser aplicado à produção de camundongos floxed.
A eletroporação é um método altamente generalizado de produção de camundongos editados pelo genoma devido ao baixo custo dos dispositivos experimentais e à facilidade de aprendizado da técnica8. Além disso, o método i-GONAD19, no qual a edição do genoma é feita com embriões pré-implantacionais existentes no oviduto, não requer um camundongo receptor. Comparado a esses métodos, o presente método aqui apresentado é caro e demorado na preparação e manutenção de um ambiente experimental em termos de hardware e software. No entanto, uma vez que as instalações experimentais são montadas, camundongos complexos de gênico knock-in e floxed podem ser produzidos apenas com elementos CRISPR comercialmente disponíveis (crRNA, tracrRNA e proteína Cas9) e uma quantidade simples e pequena de vetor plasmidial circular para ser usado como DNA do doador. Isso significa que muitas linhagens complexas de camundongos editadas pelo genoma podem ser produzidas sem a necessidade de preparação de vetores de vírus lsODN 5,6 ou adenoassociados20 demorados (ou relativamente caros).
Ao contrário do método original SPRINT-CRISPR15, zigotos frescos (congelados-descongelados) foram usados. Na obtenção de zigotos frescos por acasalamento natural, podem ser ignorados os erros técnicos que podem ocorrer durante a fertilização in vitro ou congelamento e descongelamento. Além disso, o processo de manipulação embrionária pode ser concluído em aproximadamente meio dia (Figura 1) seguindo a abordagem atual. Por outro lado, algumas limitações do presente método incluem a exigência de muitos camundongos machos, o controle frouxo do tempo de fertilização e a capacidade limitada de prever completamente o número de zigotos para microinjeção. Em comparação com o método SPRINT-CRISPR original, este método pode ter uma taxa de natalidade mais elevada (Tabela 1). Apesar disso, não se pode concluir que o presente método seja melhor em termos de taxa de natalidade devido às diferenças nos condutores do experimento, genes-alvo, antecedentes genéticos e tempo de confirmação do embrião.
Como mostrado na Tabela 1, um grande número de camundongos na maioria dos projetos de knock-in de genético apresentou alelos de integração aleatória. A integração aleatória deve ser eliminada, pois pode levar à ruptura não intencional de genes endógenos e à expressão ectópica de transgenes. O desafio para o futuro é encontrar condições experimentais que reduzam o número de eventos de integração aleatória, mantendo eficiência suficiente.
Quase toda a edição do genoma do zigoto de camundongo usando efetores de edição do genoma que resultam em quebras de fita dupla do DNA provavelmente induz mutações não intencionais em locais no alvo 9,21. Os resultados dessas mutações não intencionais no alvo não são descritos aqui porque não estamos em uma situação em que a próxima geração de camundongos possa ser manejada para apresentar evidências claras delas. A melhor maneira de descartar a preocupação de confusão causada por mutagênese não intencional no alvo é obter a próxima geração de camundongos acasalando fundadores com camundongos selvagens em vez de cruzar fundadores. Em princípio, os camundongos N1 resultantes desse cruzamento são selvagens (WT) em um lado do alelo, portanto, se o alelo knock-in pretendido (KI) for detectado, eles são heterozigotos WT/KI. Portanto, a mutagênese no alvo não é um problema crítico no camundongo de laboratório, que tem um ciclo de vida relativamente rápido e é um animal prolífico. No entanto, serão necessárias melhorias adicionais quando esta tecnologia for aplicada a mamíferos relativamente grandes.
Confirmou-se que esta tecnologia pode produzir camundongos knock-in de genético em linhagens diferentes de C57BL/6J, mas um número suficiente de projetos não é assegurado, e os dados são altamente variáveis. Por esse motivo, essa informação não está incluída no presente estudo. Acredita-se que mais estudos sobre este assunto serão necessários para avançar na pesquisa em genética de camundongos e modelos de doenças.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por Investigação Científica (B) (19H03142: a SM), Investigação Científica (A) (20H00444: a FS), Investigação Científica (A) (21H04838: a SM) e Investigação Científica em Áreas Inovadoras “Plataforma de Apoio a Modelo Animal Avançado” (16H06276: a ST) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito. Somos gratos a Ryoichi Mori por sua discussão útil sobre o design de edição do genoma.
Materials
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | – | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | – | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | – | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | – | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | – |
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