マウスの遺伝子カセットノックインおよびフロックス対立遺伝子を作成するための接合子マイクロインジェクション

すべての動物実験は、筑波大学動物実験規程及び文部科学省所管の学術研究機関における動物実験等の適正な実施に関する基本指針に基づき、筑波大学機関動物実験委員会の承認を得て人道的に実施されたこと。 日本の文化・スポーツ・科学技術.10〜25週齢の男女のC57BL/6Jマウスを接合子ドナーとして使用した。ICRマウス(10週齢)をレシピエントマウスとして用いた。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。 1. 無細胞系におけるcrRNA切断活性の確認 2 nmolのcrRNA(乾燥)および20 nmolのtracrRNA(乾燥)をそれぞれ25 μLおよび250 μLのRNaseフリー水に溶解します( 材料の表を参照)。注:切断活性が高く、オフターゲットができるだけ少ないと予測されたCRISPRターゲット配列は、CRISPORを使用して選択されます( 材料の表を参照)。遺伝子カセットノックインの場合は、挿入部位を横切って配列を標的にします。フロックスするエクソンは、KOnezumiを使用して選択しました( 材料表を参照)。 ゲノムPCR9によって標的部位を含むDNA断片(約0.5〜1kb)を増幅します。このPCRアンプリコンを一般的なPCR産物抽出キットで精製します(材料の表を参照)。 10 μLのCRISPR混合物を調製します(Cas9ヌクレアーゼ反応バッファーに100 ng/μLのcrRNA、150 ng/μLのtracrRNA、および1 ng/μLのCas9、 材料表を参照)。CRISPR-Cas9複合体を構築するには、CRISPR混合物を37°Cのヒートブロックに30分間入れます。 ステップ1.2に記載のPCR産物(10 μL、20 ng/μL)にCRISPR混合物の全量(10 μL)を加え、37°Cで1時間インキュベートします。電気泳動中にRNAが存在しないため、1 μLのRNase(500 ng/μL)を加えてcrRNAとtracrRNAを37°Cで30分間分解します。ドデシル硫酸ナトリウム(2% w/v)を含むローディング色素を用いて、上記のサンプルの電気泳動を行います。注:まれに、切断活性のないcrRNAが観察されます。このような場合は、ゲノム編集デザインを再設計することをお勧めします。 2. 接合子マイクロインジェクションのためのcrRNA、tracrRNA、Cas9タンパク質、およびドナーDNAの混合物の調製 CRISPR溶液(50 ng/μLのcrRNA、200 ng/μLのtracrRNA、および200 ng/μLのCas9をRNaseフリー水中で)を調製します。ドナーDNA溶液(20 ng/μLの自己構築プラスミドDNAベクター)を調製します。ドナーDNA溶液を、孔径0.22μmの滅菌シリンジフィルターでろ過します。等量のCRISPR溶液とろ過されたドナーDNA溶液を混合します。それぞれの最終濃度が25 ng/μLのcrRNA、100 ng/μLのtracrRNA、100 ng/μLのCas9、および10 ng/μLのドナーDNAであることを確認してください。この混合物を以後RNPDと呼ぶことにする。注:フロックスマウスの作製中など、2つの部位を切断する場合、各crRNAの濃度は25 ng / μLでなければなりません。ドナーDNAは環状プラスミドDNAであり、一般的なミニ分取スピンカラムキットで精製できます( 材料表を参照)。調製した溶液を氷上に置き、できるだけ早くマイクロインジェクションに使用する必要があります。 3. 自然交配によるマウス接合体の入手 マイクロインジェクションの3日前に、妊娠中の牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG、 材料の表を参照)をC57BL / 6J雌マウス(10〜25週齢)に皮下注射します。.約46〜48時間後、5IUのヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG、 材料の表を参照)を腹腔内に投与する。PMSGおよびhCG処理された雌マウスを雄のC57BL / 6Jマウスと共存させ、翌朝膣栓をチェックします。注:1匹の雌C57BL / 6Jマウスから約15〜25個の接合子を得ることができます。タイムラインを 図 1 に示します。 図2に示すように、接合子培養用の35 mmペトリ皿を 2枚用意します。使用するまでインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れます。これらは一晩保管することができます。 頸部脱臼によって確認された膣栓で雌マウスを安楽死させ、小さなハサミを使用して、下腹部の正中線から肋骨の下まで腹部の皮膚と筋肉層を切開します。注:安楽死については、地元の動物倫理委員会の推奨事項に従ってください。 卵管を収集し、ペトリ皿の蓋にある0.75 mg / mLのヒアルロニダーゼ( 材料の表を参照)を含むM2培地の20 μL滴に入れます。細い先端鉗子で卵管を1つピックアップし、約50 μLのM2培地をヒアルロニダーゼとともにフィンブリエに灌流します。注:現時点では、接合子は多数の積雲細胞に緩やかに囲まれています。 30秒後、ガラスキャピラリーを使用して少量の培地で形態学的に正常な接合子をピックアップし、新鮮なM16培地液滴に移して洗浄します。洗浄した接合子をペトリ皿(図2)に移してプーリングします。メモ: タイムラインを 図 1 に示します。形態学的に正常な接合子は、雄と雌の前核と、球形をひどく損なっていない2つの極体を持っています15。接合子の形態は、系統や種によってかなり異なります。 すべての接合子が取得されるまで、手順 3.3 と 3.4 を繰り返します。約100個の接合子を培養皿に1つのM16ドロップにプールできます。マイクロインジェクションまでインキュベーター(37°C、5%CO2)にディッシュを保存する。 4.マイクロインジェクションニードルの調製 プログラム可能なピペットプーラーを使用して、いくつかのガラスピペットを引きます(材料の表を参照)。注意: マイクロインジェクションニードルは、細い先端と長いテーパーを備えている必要があります。プーラーが細胞質内精子注入用の針を作るためのプログラムを持っている場合、同じプログラムを使用してマイクロインジェクション用の針を作ることができます。 マイクロフォージ先端に付いているガラス玉を叩いてマイクロ注入針の先端を折る。マイクロインジェクションニードルの先端サイズが直径約1μmであることを確認してください。顕微鏡で先端サイズを1000倍の倍率で確認してください。 マイクロフォージを使用して、先端から約2〜3 mmでマイクロ注入針を曲げます。注意: 曲げの角度は、マイクロマニピュレーターのセットアップによって異なります。曲げすぎると、ピエゾパルスの効果が低下します。 5.接合子マイクロインジェクション 1〜1.5cmの操作液(水銀の代わりにピエゾ効果が穴を開けるために必要な慣性体、 材料の表を参照)をマイクロインジェクションニードルの中央に注入し、ピエゾアクチュエータで手動マイクロインジェクターホルダーに取り付けます。さらに、保持針を反対側の手動マイクロインジェクターホルダーに取り付けます。操作液をマイクロインジェクション針先に徐々に圧力で移動させます。両方の手動マイクロインジェクターホルダーをマイクロマニピュレーターに固定します。注:マイクロインジェクションニードルの先端から出てくる手術液は、顕微鏡で50倍の倍率で観察できます。放出される液体の量を調整した後、ピエゾパルスが印加されたときに液体の飛散を観察することができ、ピエゾパルスが有効であることが確認されます。これが確認できない場合は、マイクロインジェクションニードルを再準備してください。 3つの液滴を含む注入チャンバーを準備します:(1)10μLのM2培地;(2)M2培地中の5μLの12%ポリビニルピロリドン(PVP);(3)crRNA、tracrRNA、Cas9タンパク質、およびドナーDNA(RNPD)溶液の5 μL混合物。ステップ3.2と同様に液滴を鉱物油で覆い、注入チャンバーを倒立顕微鏡ステージにセットします。倒立顕微鏡で50倍の倍率で、マイクロインジェクションピペットを12%PVPドロップまで下げます。12%PVPを吸引して分注し、マイクロインジェクション針先の内側を洗浄し、RNPD液滴に移します。 手動マイクロインジェクターを負圧下に置き、RNPD溶液をマイクロインジェクションニードルに吸い上げます。十分な音量が吸引されるまで数分待ちます。50倍に拡大した顕微鏡下で、マイクロインジェクションニードルの内側全体を液体で満たします。吸気を停止し、手動マイクロインジェクターを陽圧に設定してRNPD溶液を徐々に排出できるようにします。マイクロインジェクションニードルの先端をオイルに動かします。注意: 手動マイクロインジェクターのノブを反時計回りに回して吸入します。吸入を停止するには、ノブを時計回りに回し、顕微鏡で観察しながら徐々に圧力を上げます。RNPD溶液は徐々に排出されます。マイクロインジェクションニードル内の液面移動により、流出の確認が可能です。 M2液滴に50個の接合子を入れ、保持ピペットを同じ液滴に静かに下げます。マイクロインジェクションニードルを接合子を含むM2ドロップに移します。20倍の対物レンズに切り替えて、マイクロインジェクションピペットの先端に焦点を合わせます。注:10分で注入できる接合子をできるだけ多く入れます。 接合子を持ち、マイクロマニピュレーターを動かして前核に焦点を合わせます。マイクロインジェクションニードルを接合子に挿入し、先端を前核に近づけます。先端が前核膜に到達したら、ピエゾパルス(強度:6-10、速度:1)を印加して穴を開けます。マイクロインジェクション針が前核に穿刺したら、RNPD溶液を注入し、前核の腫れを観察します。前核が完全に膨らんだら、すぐに針を引き抜きます。女性と男性の両方の前核で同じ手順を実行します。注:注射による前核の膨張は、顕微鏡ではっきりと見ることができます。このインフレの程度を言語化することは困難ですが、以前のレポートを参照することで確認できます15。 注入した接合子をM2液滴内の別の場所に移動して、注入前後の接合子を特定します。 M5.5液滴内のすべての接合子が注入されるまで、手順5.6〜2を繰り返します。注射後、接合子を新鮮なM16皿に移します。 注射の10分後に生き残った接合子を選択します。注射によって損傷した溶解した接合子を取り除き、生き残った接合子をM16皿の各液滴に分配します。各液滴は、1人の偽妊娠女性に対して20〜24個の接合子を含まなければなりません。これにより、M16ディッシュが胚移植中にインキュベーター外の環境にさらされる時間が短縮されます。注意: 最適な注入条件下では、生存率は90%〜95%です。これは、針先のサイズ、ピエゾパルスの強さ、およびRNPD溶液の流出圧力に依存します。 6.卵管への胚移植 偽妊娠マウスを得るために、発情前期の各雌ICRマウスを血管結紮した雄ICRマウスと交配させる。翌日プラグを確認してください。注:約15匹の偽妊娠マウスが20組の交配ペアから得られます。 3種類の混合麻酔薬(0.2 mg / kgのメデトミジン、4.0 mg / kgのミダゾラム、および2.5 mg / kgのブトルファノール、 材料の表を参照)を偽妊娠中の雌マウスに皮下投与します。.呼吸数の低下と尾挟みと後肢ペダルの離脱反射の消失により、適切な麻酔を確認します。眼科用軟膏を塗布して、地元の動物倫理委員会の推奨事項に従って目を滑らかにします。 マウスの背部を腹臥位で剃り、手術部位をヨウ素またはクロルヘキシジンベースのスクラブとアルコールを交互に3回消毒した後、背側皮膚を脊椎に沿って約1 cm切開します。 背側切開創を腹側の片側に移動し、卵巣が見える筋肉層を切開し、ピンセットで卵巣の上の脂肪をつかみ、卵巣、卵管、子宮を抜く。セレファインクランプで脂肪を固定します( 材料表を参照)。コートとの直接接触を避けるために、生殖組織を滅菌ガーゼの上に置きます。 次の順序で、少量の培養液(M2またはM16)、マーカーとして気泡を入れ、接合子をピペットに入れて移します。注:卵管あたり約10〜12個の接合子を移します。 膨大部と卵管の線毛の間にマイクロせん断( 材料の表を参照)を使用して切開を行い(ガラスピペットが入るのに十分な長さ)、接合子を切開部に導入し、同時に気泡が導入されていることを確認します。 同様に他の卵管への移植を行う(ステップ6.6)。 オートクリップで外皮を縫合します( 材料表を参照)。注:切開創がやむを得ず大きくない限り、切開された筋肉層を縫合しないでください。切開された筋肉層の理想的なサイズは2〜3 mm未満でなければなりません。切開が5 mmを超える場合は、滅菌した縫合針と糸を使用して筋肉層を縫合する必要があります( 材料の表を参照)。 7.動物の回復 塩酸アチパメゾール(0.3 mg / kg)をマウスに皮下投与します。.注:術後鎮痛については、地元の動物倫理委員会の推奨事項に従ってください。 次に、マウスをケージに入れ、37°Cのホットプレートで保温します。 マウスが目覚めた後、約2時間暖かく保ちます。マウスの異常な行動がないことを確認したら、ケージを飼育ラックに戻します。