Micro-injection de zygote pour la création d’allèles knock-in et flox de cassette génique chez la souris
Summary
Le présent protocole décrit la micro-injection de zygotes de CRISPR-Cas9 et d’ADN de donneur pour produire efficacement des souris frappées par cassette de gènes et floxées.
Abstract
La technologie CRISPR-Cas a permis la génération rapide et sans effort de souris génétiquement modifiées. Plus précisément, les souris et les souris mutantes ponctuelles sont facilement produites par électroporation des facteurs CRISPR (et des donneurs d’ADN oligo simple brin) dans le zygote. En revanche, les souris knock-in et floxed de cassette de gènes (>1 kb) sont principalement générées par micro-injection de facteurs CRISPR et de donneurs d’ADN double brin dans des zygotes. Les technologies d’édition du génome ont également accru la flexibilité de la production de souris génétiquement modifiées. Il est maintenant possible d’introduire les mutations prévues dans les régions génomiques cibles dans un certain nombre de souches de souris consanguines bénéfiques. Notre équipe a produit plus de 200 lignées de souris knock-in de cassettes de gènes et plus de 110 lignées de souris floxées par microinjection zygote de CRISPR-Cas9 suite à des demandes de plusieurs pays, dont le Japon. Certaines de ces modifications du génome ont utilisé des souches consanguines BALB / c, C3H / HeJ et C57BL / 6N, mais la plupart ont utilisé C57BL / 6J. Contrairement à la méthode d’électroporation, l’édition du génome par microinjection de zygote dans diverses souches consanguines de souris n’est pas si facile. Cependant, les souris knock-in et floxed sur des antécédents génétiques consanguins uniques sont aussi critiques que les modèles de souris humanisées génétiques, fluorescentes et knockout conditionnelles. Par conséquent, cet article présente le protocole pour la micro-injection zygote de facteurs CRISPR et de donneurs d’ADN double brin chez des souris C57BL / 6J pour générer des souris knock-in de cassette de gènes et floxed. Cet article se concentre exclusivement sur l’injection nucléaire plutôt que sur l’injection cytoplasmique. En plus de la micro-injection de zygote, nous décrivons le calendrier du processus de production et des techniques périphériques telles que l’induction de la superovulation et le transfert d’embryons.
Introduction
Les souris knock-in, chez lesquelles les gènes exogènes prévus sont introduits aux loci cibles, sont largement utilisées dans de nombreuses études in vivo en tant que souris humanisées par gène, souris rapporteures fluorescentes et souris pilotesCre 1,2. Lorsque des mutations knock-in sont induites par l’édition du génome chez des zygotes de souris, l’ADN simple brin (donneurs d’ADN oligo simple brin, ssODN) ou l’ADN double brin (ADNds) est utilisé comme ADN donneur 2,3. ssODN est principalement utilisé pour frapper des fragments de gènes relativement courts de moins de 200 bp4. Il est possible d’introduire des fragments de plus de 1 kb d’ADN en utilisant de longs ssODN (lsODN)5,6, mais leur préparation prend beaucoup de temps. Lorsque des donneurs d’ADNds sont utilisés, des souris knock-in à cassette génétique (>1 kb) peuvent être générées sans préparation laborieuse de l’ADN du donneur7.
Le principal avantage de l’utilisation de ssODN est que l’électroporation8 peut générer des souris knock-in. Cependant, les donneurs d’ADNds doivent être introduits directement dans le noyau par micro-injection de zygote. Un knock-in simultané sur deux sites est nécessaire pour créer des souris floxées, dans lesquelles chaque séquence loxP est frappée en amont et en aval du gène cible. Il existe deux façons de générer des souris floxed par édition du génome dans des zygotes de souris – en utilisant deux ssODN indépendants, chacun portant un seul site loxP, ou en utilisant un seul dsDNA (ou lsDNA) avec une séquence floxée; Le premier est très inefficace 9,10,11. L’édition du génome à l’aide de donneurs d’ADNds est l’approche la plus simple pour produire des souris frappées par cassette de gènes et floxed si l’environnement est propice à la micro-injection de zygote.
Initialement, des mélanges d’ARNm Cas9 et de sgRNA ou de vecteurs d’ADN codant pour l’ARNg et Cas9 sont utilisés pour l’édition du génome chez les zygotesde souris 12,13. Étant donné que des protéines Cas9 stables et de haute qualité sont maintenant disponibles à faible coût, l’introduction de la ribonucléoprotéine (RNP) ARNcr-tracrRNA-Cas9 dans les zygotesde souris 14 est devenue populaire. Récemment, des souris knock-in ont été générées avec une grande efficacité en introduisant le RNR ARNcr-tracrRNA-Cas9 RNP et l’ADN du donneur dans les deux pronuclei des zygotes de souris dans une phase de cycle cellulaire où le knock-in est le plus susceptible de se produire15. Par conséquent, le présent protocole décrit des techniques pour produire différents types de souris knock-in par cette méthode.
Il existe de nombreuses souches consanguines utiles de souris de laboratoire16. La modification génétique dans le contexte consanguin peut ignorer l’influence du fond génétique sur le phénotype. Cet article décrit une méthode pour induire des mutations de cassette de gènes knock-in et floxed dans le zygote de la lignée de souris consanguine la plus couramment utilisée, la C57BL/6J17. En outre, le calendrier de génération de souris génétiquement modifiées et les techniques périphériques utilisées sont également discutés, y compris l’induction de la superovulation et le transfert d’embryons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans la présente étude, des zygotes de souris C57BL/6J frais (non congelés-décongelés), obtenus à partir d’accouplement naturel, ont été utilisés pour la production de souris d’édition du génome. En injectant de l’ARNcr-tracrRNA-Cas9 et de l’ADN du donneur (RNPD) dans les deux pronuclei de ces zygotes dans une phase de cycle cellulaire où le knock-in est le plus susceptible de se produire, des souris frappées par cassette de gènes et floxed ont été générées avec un taux de natalité élevé et une efficacité d’édition du génome suffisante. La présente étude renforce l’extensibilité de la méthode SPRINT-CRISPR15, où elle garantit une efficacité de knock-in suffisante même dans le fond génétique C57BL/6J, et peut être appliquée à la production de souris floxées.
L’électroporation est une méthode très généralisée de production de souris génétiquement modifiées en raison du faible coût des dispositifs expérimentaux et de la facilité d’apprentissage de la technique8. De plus, la méthode i-GONAD19, dans laquelle l’édition du génome est effectuée avec des embryons préimplantatoires existant dans l’oviducte, ne nécessite pas de souris receveuse. Par rapport à ces méthodes, la méthode actuelle présentée ici est coûteuse et prend beaucoup de temps lors de la préparation et de la maintenance d’un environnement expérimental en termes de matériel et de logiciel. Cependant, une fois les installations expérimentales mises en place, des souris complexes à cassettes de gènes knock-in et floxed peuvent être produites avec uniquement des éléments CRISPR disponibles dans le commerce (ARNcr, ARNtrac et protéine Cas9) et une simple et petite quantité de vecteur plasmidique circulaire à utiliser comme ADN de donneur. Cela signifie que de nombreuses lignées de souris complexes modifiées par le génome peuvent être produites sans avoir besoin de lsODN 5,6 ou de vecteurs de virus adéno-associés20 qui prennent beaucoup de temps (ou relativement coûteux) pour se préparer.
Contrairement à la méthode originale SPRINT-CRISPR15, des zygotes frais (congelés-décongelés) ont été utilisés. Lors de l’obtention de zygotes frais par accouplement naturel, les erreurs techniques qui peuvent survenir lors de la fécondation in vitro ou de la congélation et de la décongélation peuvent être ignorées. De plus, le processus de manipulation des embryons peut être complété en une demi-journée environ (Figure 1) suivant l’approche actuelle. D’autre part, certaines limites de la méthode actuelle incluent l’exigence de nombreuses souris mâles, le contrôle lâche du moment de la fécondation et la capacité limitée de prédire complètement le nombre de zygotes pour la micro-injection. Par rapport à la méthode originale SPRINT-CRISPR, cette méthode peut avoir un taux de natalité plus élevé (tableau 1). Malgré cela, on ne peut pas conclure que la méthode actuelle est meilleure en termes de taux de natalité en raison des différences dans les conducteurs de l’expérience, les gènes cibles, les antécédents génétiques et le moment de la confirmation de l’embryon.
Comme le montre le tableau 1, un grand nombre de souris dans la plupart des projets de knock-in de cassettes de gènes avaient des allèles d’intégration aléatoires. L’intégration aléatoire doit être éliminée car elle peut entraîner une perturbation involontaire des gènes endogènes et de l’expression ectopique des transgènes. Le défi pour l’avenir est de trouver des conditions expérimentales qui réduisent le nombre d’événements d’intégration aléatoires tout en maintenant une efficacité suffisante en matière de knock-in.
Presque toutes les modifications du génome zygote de souris utilisant des effecteurs d’édition du génome qui entraînent des cassures double brin de l’ADN sont susceptibles d’induire des mutations involontaires sur les sites cibles 9,21. Les résultats de ces mutations involontaires sur la cible ne sont pas décrits ici parce que nous ne sommes pas dans une situation dans laquelle la prochaine génération de souris peut être gérée afin d’en présenter des preuves claires. La meilleure façon d’éliminer le souci de confusion causé par la mutagénèse involontaire sur cible est d’obtenir la prochaine génération de souris en accouplant les fondateurs avec des souris de type sauvage plutôt qu’en croisant les fondateurs. En principe, les souris N1 résultant de ce croisement sont de type sauvage (WT) sur un côté de l’allèle, donc si l’allèle knock-in (KI) prévu est détecté, elles sont hétérozygotes WT/KI. Par conséquent, la mutagénèse sur cible n’est pas un problème critique chez la souris de laboratoire, qui a un cycle de vie relativement rapide et est un animal prolifique. Cependant, d’autres améliorations seront nécessaires lorsque cette technologie sera appliquée à des mammifères relativement grands.
Il a été confirmé que cette technologie peut produire des souris knock-in par cassette génétique dans des souches consanguines autres que C57BL/6J, mais un nombre suffisant de projets ne sont pas sécurisés et les données sont très variables. Pour cette raison, cette information n’est pas incluse dans la présente étude. On pense que d’autres études sur ce sujet seront nécessaires pour faire progresser la génétique de la souris et la recherche sur les modèles de maladies.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la recherche scientifique (B) (19H03142: à SM), la recherche scientifique (A) (20H00444: à FS), la recherche scientifique (A) (21H04838: à SM) et la recherche scientifique sur les domaines innovants « Platform of Advanced Animal Model Support » (16H06276: à ST) du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Nous sommes reconnaissants à Ryoichi Mori pour sa discussion utile sur la conception de l’édition du génome.
Materials
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | – | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | – | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | – | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | – | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | – |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
