الحقن المجهري للزيجوت لإنشاء أليلات كاسيت الجينات وأليلات فلوكس في الفئران
Summary
يصف البروتوكول الحالي الحقن المجهري للزيجوت ل CRISPR-Cas9 والحمض النووي للمتبرع لإنتاج فئران كاسيت الجينات وفئرانها المتخبطة بكفاءة.
Abstract
مكنت تقنية كريسبر-كاس من توليد الفئران المعدلة وراثيا بسرعة وبدون عناء. على وجه التحديد ، يتم إنتاج الفئران والفئران الطافرة النقطية بسهولة عن طريق التثقيب الكهربائي لعوامل كريسبر (ومتبرعي الحمض النووي قليل التقطعت بهم السبل) في الزيجوت. في المقابل ، يتم إنشاء كاسيت الجينات (>1 كيلوبايت) والفئران المتخبطة بشكل أساسي عن طريق الحقن المجهري لعوامل كريسبر والمتبرعين بالحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل في الزيجوت. كما زادت تقنيات تحرير الجينوم من مرونة إنتاج الفئران المعدلة وراثيا. أصبح من الممكن الآن إدخال الطفرات المقصودة في المناطق الجينومية المستهدفة في عدد من سلالات الفئران الفطرية المفيدة. أنتج فريقنا أكثر من 200 خط فأر كاسيت جيني ، وأكثر من 110 خطوط فأر متخبطة عن طريق الحقن المجهري للزيجوت ل CRISPR-Cas9 بعد طلبات من العديد من البلدان ، بما في ذلك اليابان. استخدمت بعض عمليات تحرير الجينوم هذه سلالات BALB / c و C3H / HeJ و C57BL / 6N الفطرية ، ولكن معظمها يستخدم C57BL / 6J. على عكس طريقة التثقيب الكهربائي ، فإن تحرير الجينوم عن طريق الحقن المجهري للزيجوت في سلالات مختلفة من الفئران ليس بهذه السهولة. ومع ذلك ، فإن الفئران الكاسيت الجيني والفئران المتخبطة على خلفيات وراثية فطرية واحدة لا تقل أهمية عن نماذج الفئران الجينية المتوافقة مع البشر والفلورسنت والضربة القاضية المشروطة. لذلك ، تقدم هذه المقالة بروتوكول الحقن المجهري للزيجوت لعوامل كريسبر والمتبرعين بالحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل في الفئران C57BL / 6J لتوليد الفئران الكاسيت والفئران المتخبطة. تركز هذه المقالة حصريا على الحقن النووي بدلا من الحقن السيتوبلازمي. بالإضافة إلى الحقن المجهري للزيجوت ، نحدد الجدول الزمني لعملية الإنتاج والتقنيات المحيطية مثل تحريض الإباضة الفائقة ونقل الأجنة.
Introduction
تستخدم الفئران الضربة القاضية ، التي يتم فيها إدخال الجينات الخارجية المقصودة في الموقع المستهدف ، على نطاق واسع في العديد من الدراسات في الجسم الحي مثل الفئران المؤنسنة الجينية ، والفئران المراسل الفلورية ، والفئران سائق Cre 1,2. عندما يتم إحداث طفرات غير ناجحة عن طريق تحرير الجينوم في زيجوت الفأر ، يتم استخدام الحمض النووي أحادي الشريط (متبرعو الحمض النووي قليل الجديلة ، ssODN) أو الحمض النووي المزدوج الذي تقطعت بهم السبل (dsDNA) كحمض نووي متبرع 2,3. يستخدم ssODN بشكل أساسي لضرب شظايا جينية قصيرة نسبيا أقل من 200 bp4. من الممكن ضرب شظايا أطول من 1 كيلو بايت من الحمض النووي باستخدام ssODNs طويلة (lsODN) 5,6 ، ولكن تحضيرها يستغرق وقتا طويلا. عند استخدام متبرعين ب dsDNA ، يمكن إنشاء فئران كاسيت جيني (>1 كيلو بايت) دون تحضير الحمض النووي الشاقللمتبرع 7.
الميزة الرئيسية لاستخدام ssODNs هي أن التثقيب الكهربائي8 يمكن أن يولد فئران غير مطرودة. ومع ذلك ، يجب إدخال متبرعي dsDNA مباشرة في النواة عن طريق الحقن المجهري للزيجوت. مطلوب ضربة قاضية متزامنة في موقعين لإنشاء فئران متخبطة ، حيث يتم ضرب كل تسلسل loxP في المنبع والمصب للجين المستهدف. هناك طريقتان لتوليد الفئران المتخبطة عن طريق تحرير الجينوم في زيجوت الفئران باستخدام اثنين من ssODNs المستقلة ، كل منهما يحمل موقع loxP واحد ، أو باستخدام dsDNA واحد (أو lsDNA) مع تسلسل متخبط. الأول غير فعال للغاية9،10،11. يعد تحرير الجينوم باستخدام الجهات المانحة dsDNA أبسط طريقة لإنتاج الفئران ذات الكاسيت الجيني والفئران المتخبطة إذا كانت البيئة مواتية للحقن المجهري للزيجوت.
في البداية ، يتم استخدام مخاليط Cas9 mRNA و sgRNA أو ناقلات الحمض النووي التي تشفر sgRNA و Cas9 لتحرير الجينوم في زيجوت الفأر12,13. نظرا لأن بروتينات Cas9 عالية الجودة والمستقرة متوفرة الآن بتكلفة منخفضة ، فقد أصبح إدخال البروتين النووي الريبي crRNA-Cas9 (RNP) في زيجوت الماوس14 شائعا. في الآونة الأخيرة ، تم إنشاء الفئران الضربة القاضية بكفاءة عالية من خلال إدخال crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP والحمض النووي للمانح في كل من نواة زيجوت الفأر في مرحلة دورة الخلية حيث من المرجح أن تحدث الضربة القاضية15. لذلك ، يصف البروتوكول الحالي تقنيات لإنتاج أنواع مختلفة من الفئران الضربة القاضية بهذه الطريقة.
هناك العديد من السلالات الفطرية المفيدة من الفئران المختبرية16. يمكن أن يتجاهل التعديل الوراثي داخل الخلفية الفطرية تأثير الخلفية الجينية على النمط الظاهري. توضح هذه المقالة طريقة لإحداث طفرات كاسيت الجين والطفرات المتخبطة في الزيجوت لخط الفأر الفطري الأكثر استخداما ، C57BL / 6J17. علاوة على ذلك ، تمت مناقشة الجدول الزمني لتوليد الفئران المعدلة وراثيا والتقنيات المحيطية المستخدمة ، بما في ذلك تحريض الإباضة الفائقة ونقل الأجنة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الدراسة الحالية ، تم استخدام زيجوت الفأر C57BL / 6J الطازجة (غير المجمدة المذابة) ، التي تم الحصول عليها من التزاوج الطبيعي ، لإنتاج فأر تحرير الجينوم. عن طريق حقن crRNA-tracrRNA-Cas9 والحمض النووي للمتبرع (RNPD) في كل من نواة هذه الزيجوت في مرحلة دورة الخلية حيث من المرجح أن تحدث ضربة قاضية ، تم إنشاء كاسيت الجينات والفئران المتخبطة بمعدل مواليد مرتفع وكفاءة كافية في تحرير الجينوم. تعزز الدراسة الحالية قابلية التوسع لطريقة SPRINT-CRISPR15 ، حيث تضمن كفاءة كافية حتى في الخلفية الجينية C57BL / 6J ، ويمكن تطبيقها على إنتاج الفئران المتخبطة.
التثقيب الكهربائي هو طريقة معممة للغاية لإنتاج الفئران المحررة بالجينوم بسبب التكلفة المنخفضة للأجهزة التجريبية وسهولة تعلم التقنية8. علاوة على ذلك ، فإن طريقة i-GONAD19 ، التي يتم فيها تحرير الجينوم مع الأجنة قبل الزرع الموجودة في قناة البيض ، لا تتطلب فأرا متلقيا. بالمقارنة مع هذه الطرق ، فإن الطريقة الحالية المعروضة هنا مكلفة وتستغرق وقتا طويلا عند إعداد وصيانة بيئة تجريبية من حيث كل من الأجهزة والبرامج. ومع ذلك ، بمجرد إنشاء المرافق التجريبية ، يمكن إنتاج الفئران المعقدة من الكاسيت الجيني والفئران المتخبطة باستخدام عناصر CRISPR المتاحة تجاريا فقط (crRNA و tracrRNA وبروتين Cas9) وكمية بسيطة وصغيرة من ناقل البلازميد الدائري لاستخدامها كحمض نووي متبرع. هذا يعني أنه يمكن إنتاج العديد من خطوط الماوس المعقدة المحررة بالجينوم دون الحاجة إلى تحضير lsODN 5,6 أو ناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدي20 التي تستغرق وقتا طويلا (أو مكلفة نسبيا).
على عكس طريقة SPRINT-CRISPR الأصلية15 ، تم استخدام زيجوت طازجة (مجمدة مذابة). عند الحصول على الزيجوت الطازج عن طريق التزاوج الطبيعي ، يمكن تجاهل الأخطاء الفنية التي قد تحدث أثناء الإخصاب في المختبر أو التجميد والذوبان. أيضا ، يمكن إكمال عملية معالجة الأجنة في حوالي نصف يوم (الشكل 1) باتباع النهج الحالي. من ناحية أخرى ، تتضمن بعض قيود الطريقة الحالية متطلبات العديد من ذكور الفئران ، والتحكم الفضفاض في توقيت الإخصاب ، والقدرة المحدودة على التنبؤ الكامل بعدد الزيجوت للحقن المجهري. بالمقارنة مع طريقة SPRINT-CRISPR الأصلية ، قد يكون لهذه الطريقة معدل مواليد أعلى (الجدول 1). على الرغم من ذلك ، لا يمكن استنتاج أن الطريقة الحالية أفضل من حيث معدل المواليد بسبب الاختلافات في موصلات التجربة والجينات المستهدفة والخلفيات الجينية وتوقيت تأكيد الجنين.
كما هو موضح في الجدول 1 ، كان لدى عدد كبير من الفئران في معظم مشاريع كاسيت الجينات أليلات تكامل عشوائية. يجب القضاء على التكامل العشوائي لأنه يمكن أن يؤدي إلى تعطيل غير مقصود للجينات الداخلية والتعبير خارج الرحم عن الجينات المحورة. يتمثل التحدي في المستقبل في إيجاد ظروف تجريبية تقلل من عدد أحداث التكامل العشوائي مع الحفاظ على كفاءة كافية في الضربة.
من المرجح أن يؤدي تحرير جينوم زيجوت الفأر تقريبا باستخدام مستجيبات تحرير الجينوم التي تؤدي إلى فواصل مزدوجة الحمض النووي إلى حدوث طفرات غير مقصودة في المواقع المستهدفة 9,21. لم يتم وصف نتائج هذه الطفرات غير المقصودة على الهدف هنا لأننا لسنا في وضع يمكن فيه إدارة الجيل التالي من الفئران من أجل تقديم دليل واضح عليها. أفضل طريقة لاستبعاد القلق من الارتباك الناجم عن الطفرات غير المقصودة على الهدف هي الحصول على الجيل التالي من الفئران عن طريق تزاوج المؤسسين مع الفئران البرية بدلا من تهجين المؤسسين. من حيث المبدأ ، فإن الفئران N1 الناتجة عن هذا التقاطع هي من النوع البري (WT) على جانب واحد من الأليل ، لذلك إذا تم اكتشاف أليل الضربة القاضية (KI) المقصود ، فهي WT / KI متغاير الزيجوت. لذلك ، فإن الطفرات المستهدفة ليست مشكلة حرجة في فأر المختبر ، الذي له دورة حياة سريعة نسبيا وهو غزير الإنتاج. ومع ذلك ، سيكون من الضروري إجراء مزيد من التحسين عند تطبيق هذه التكنولوجيا على الثدييات الكبيرة نسبيا.
وقد تم التأكيد على أن هذه التكنولوجيا يمكن أن تنتج فئران كاسيت الجينات في سلالات فطرية أخرى غير C57BL / 6J ، ولكن لم يتم تأمين عدد كاف من المشاريع ، والبيانات متغيرة للغاية. ولهذا السبب، لم تدرج هذه المعلومات في هذه الدراسة. ويعتقد أنه سيكون من الضروري إجراء مزيد من الدراسات حول هذا الموضوع لتعزيز علم الوراثة للفئران وبحوث نماذج الأمراض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل البحث العلمي (B) (19H03142: إلى SM) ، والبحث العلمي (A) (20H00444: إلى FS) ، والبحث العلمي (A) (21H04838: إلى SM) ، والبحث العلمي في المجالات المبتكرة “منصة دعم النموذج الحيواني المتقدم” (16H06276: إلى ST) من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتحليلها أو قرار النشر أو إعداد المخطوطات. نحن ممتنون لريويتشي موري لمناقشته المفيدة حول تصميم تحرير الجينوم.
Materials
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | – | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | – | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | – | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | – | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | – |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
