Farelerde gen kaseti knock-in ve flox alelleri oluşturmak için zigot mikroenjeksiyonu
Summary
Mevcut protokol, gen kaseti knock-in ve flokslu fareleri verimli bir şekilde üretmek için CRISPR-Cas9 ve donör DNA’sının zigot mikroenjeksiyonunu tanımlamaktadır.
Abstract
CRISPR-Cas teknolojisi, genetiği değiştirilmiş farelerin hızlı ve zahmetsiz bir şekilde üretilmesini sağlamıştır. Spesifik olarak, fareler ve nokta mutant fareler, CRISPR faktörlerinin (ve tek sarmallı oligo DNA donörlerinin) zigot içine elektroporasyonu ile kolayca üretilir. Buna karşılık, gen kaseti (>1 kb) knock-in ve flokslu fareler esas olarak CRISPR faktörlerinin ve çift sarmallı DNA donörlerinin zigotlara mikroenjeksiyonu ile üretilir. Genom düzenleme teknolojileri, genetiği değiştirilmiş farelerin üretiminin esnekliğini de arttırmıştır. Artık hedef genomik bölgelerdeki amaçlanan mutasyonları, bir dizi faydalı inbred fare suşunda tanıtmak mümkündür. Ekibimiz, Japonya da dahil olmak üzere çeşitli ülkelerden gelen talepleri takiben CRISPR-Cas9’un zigot mikroenjeksiyonu ile 200’den fazla gen kaseti knock-in fare hattı ve 110’dan fazla flokslu fare çizgisi üretti. Bu genom düzenlemelerinden bazıları BALB / c, C3H / HeJ ve C57BL / 6N akraba suşlarını kullandı, ancak çoğu C57BL / 6J’yi kullandı. Elektroporasyon yönteminden farklı olarak, farelerin çeşitli inbred suşlarında zigot mikroenjeksiyonu ile genom düzenleme o kadar kolay değildir. Bununla birlikte, tek bir inbred genetik arka plan üzerinde gen kaseti knock-in ve floxed fareler, genetik insancıllaştırılmış, floresan muhabir ve koşullu nakavt fare modelleri kadar kritiktir. Bu nedenle, bu makalede, gen kaseti knock-in ve flokslu fareler üretmek için C57BL / 6J farelerde CRISPR faktörlerinin ve çift sarmallı DNA donörlerinin zigot mikroenjeksiyonu için protokol sunulmaktadır. Bu makale sadece sitoplazmik enjeksiyondan ziyade nükleer enjeksiyona odaklanmaktadır. Zigot mikroenjeksiyonuna ek olarak, üretim süreci ve süperovülasyonun indüksiyonu ve embriyo transferi gibi periferik teknikler için zaman çizelgesini özetliyoruz.
Introduction
Amaçlanan eksojen genlerin hedef lokuslara tanıtıldığı knock-in fareler, gen insanlaştırılmış fareler, floresan muhabir fareler ve Cre sürücü fareleri 1,2 olarak birçok in vivo çalışmada yaygın olarak kullanılmaktadır. Fare zigotlarında genom düzenleme ile knock-in mutasyonları indüklendiğinde, donör DNA2,3 olarak tek sarmallı DNA (tek sarmallı oligo DNA donörleri, ssODN) veya çift sarmallı DNA (dsDNA) kullanılır. ssODN esas olarak 200 bp4’ten daha az nispeten kısa gen parçalarını vurmak için kullanılır. Uzun ssODN’ler (lsODN)5,6 kullanarak 1 kb DNA’dan daha uzun parçaları zincirlemek mümkündür, ancak bunların hazırlanması zaman alıcıdır. dsDNA donörleri kullanıldığında, gen kaseti (>1 kb) knock-in fareleri, zahmetli donör DNA hazırlığı olmadan üretilebilir7.
SsODN’leri kullanmanın temel avantajı, elektroporasyon8’in knock-in fareler üretebilmesidir. Bununla birlikte, dsDNA donörleri zigot mikroenjeksiyonu ile doğrudan çekirdeğe verilmelidir. Her bir loxP dizisinin hedef genin yukarı ve aşağı akışına vurulduğu flokslu fareler oluşturmak için iki bölgede eşzamanlı knock-in gereklidir. Fare zigotlarında genom düzenleme yoluyla flokslu fareler üretmenin iki yolu vardır – her biri tek bir loxP bölgesi taşıyan iki bağımsız ssODN kullanarak veya flokslu bir diziye sahip tek bir dsDNA (veya lsDNA) kullanarak; birincisi çok verimsiz 9,10,11. dsDNA donörlerini kullanarak genom düzenleme, ortam zigot mikroenjeksiyonuna elverişliyse, gen kaseti knock-in ve flokslu fareler üretmek için en basit yaklaşımdır.
Başlangıçta, Cas9 mRNA ve sgRNA karışımları veya sgRNA ve Cas9’u kodlayan DNA vektörleri, fare zigotlarında genom düzenleme için kullanılır12,13. Yüksek kaliteli ve kararlı Cas9 proteinleri artık düşük bir maliyetle mevcut olduğundan, crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonükleoproteininin (RNP) fare zigotları14’e sokulması popüler hale gelmiştir. Son zamanlarda, knock-in fareleri, crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP ve donör DNA’sını, knock-in’in meydana gelme olasılığının en yüksek olduğu bir hücre döngüsü fazında fare zigotlarının her iki proçekirdeğine sokarak yüksek verimlilikle üretilmiştir15. Bu nedenle, mevcut protokol, bu yöntemle çeşitli tipte knock-in fareler üretme tekniklerini açıklamaktadır.
Laboratuvar farelerinin birçok yararlı akraba suşu vardır16. Akraba arka plan içindeki genetik modifikasyon, genetik arka planın fenotip üzerindeki etkisini göz ardı edebilir. Bu makalede, en sık kullanılan inbred fare hattı olan C57BL/6J17’nin zigotunda gen kaseti knock-in ve floksed mutasyonlarını indüklemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş farelerin üretimi için zaman çizelgesi ve süperovulasyon indüksiyonu ve embriyo transferi de dahil olmak üzere kullanılan periferik teknikler de tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, genom düzenleme fare üretimi için doğal çiftleşmeden elde edilen taze (dondurulmamış-çözülmemiş) C57BL/6J fare zigotları kullanılmıştır. crRNA-tracrRNA-Cas9 ve donör DNA’sı (RNPD), knock-in’in meydana gelme olasılığının en yüksek olduğu bir hücre döngüsü fazında bu zigotların her iki pronüklesine enjekte edilerek, gen kaseti knock-in ve flokslu fareler yüksek doğum oranı ve yeterli genom düzenleme etkinliği ile üretildi. Mevcut çalışma, C57BL / 6J genetik arka planında bile yeterli knock-in verimliliği sağladığı ve flokslu farelerin üretimine uygulanabildiği SPRINT-CRISPR yöntem15’in genişletilebilirliğini güçlendirmektedir.
Elektroporasyon, deneysel cihazların düşük maliyeti ve tekniği öğrenmenin kolaylığı nedeniyle genom düzenlenmiş fareler üretmek için oldukça genelleştirilmiş bir yöntemdir8. Ayrıca, yumurta kanalında bulunan preimplantasyon embriyolarla genom düzenlemesinin yapıldığı i-GONAD yöntemi19, alıcı fare gerektirmez. Bu yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada sunulan mevcut yöntem, hem donanım hem de yazılım açısından deneysel bir ortam hazırlarken ve sürdürürken maliyetli ve zaman alıcıdır. Bununla birlikte, deney tesisleri kurulduktan sonra, karmaşık gen kaseti knock-in ve flokslu fareler, yalnızca ticari olarak temin edilebilen CRISPR elementleri (crRNA, tracrRNA ve Cas9 proteini) ve donör DNA olarak kullanılacak basit, az miktarda dairesel plazmid vektörü ile üretilebilir. Bu, birçok karmaşık genom düzenlenmiş fare çizgisinin, hazırlanması için zaman alıcı (veya nispeten pahalı) lsODN 5,6 veya adeno ilişkili virüs vektörleri20’ye ihtiyaç duymadan üretilebileceği anlamına gelir.
Orijinal SPRINT-CRISPR yöntem15’in aksine, taze (dondurulmuş-çözülmüş) zigotlar kullanıldı. Doğal çiftleşme ile taze zigotlar elde edilirken, in vitro fertilizasyon veya donma ve çözülme sırasında oluşabilecek teknik hatalar göz ardı edilebilir. Ayrıca mevcut yaklaşımı takiben embriyo manipülasyon işlemi yaklaşık yarım günde tamamlanabilmektedir (Şekil 1). Öte yandan, mevcut yöntemin bazı sınırlamaları, birçok erkek farenin gerekliliğini, döllenme zamanlamasının gevşek kontrolünü ve mikroenjeksiyon için zigot sayısını tamamen tahmin etme yeteneğinin sınırlı olmasını içerir. Orijinal SPRINT-CRISPR yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu yöntem daha yüksek bir doğum oranına sahip olabilir (Tablo 1). Buna rağmen, deney iletkenleri, hedef genler, genetik arka planlar ve embriyo doğrulamasının zamanlamasındaki farklılıklar nedeniyle mevcut yöntemin doğum oranı açısından daha iyi olduğu sonucuna varılamamaktadır.
Tablo 1’de gösterildiği gibi, gen kaseti zincirleme projelerinin çoğunda çok sayıda farenin rastgele entegrasyon alelleri vardı. Rastgele entegrasyon ortadan kaldırılmalıdır, çünkü endojen genlerin istenmeyen şekilde bozulmasına ve transgenlerin ektopik ekspresyonuna yol açabilir. Geleceğin zorluğu, yeterli zincirleme verimliliği korurken rastgele entegrasyon olaylarının sayısını azaltan deneysel koşullar bulmaktır.
DNA çift iplikçik kırılmalarına neden olan genom düzenleme efektörleri kullanılarak yapılan hemen hemen tüm fare zigot genom düzenlemelerinin, hedef bölgelerde istenmeyen mutasyonlara neden olması muhtemeldir 9,21. Bu istenmeyen hedef mutasyonlarının sonuçları burada açıklanmamıştır, çünkü yeni nesil farelerin net kanıtlarını sunmak için yönetilebilecekleri bir durumda değiliz. İstenmeyen hedef mutajenezinin neden olduğu karışıklık endişesini ortadan kaldırmanın en iyi yolu, kurucuları kesişen kurucular yerine vahşi tip farelerle çiftleştirerek yeni nesil fareleri elde etmektir. Prensip olarak, bu haçtan kaynaklanan N1 fareleri, alelin bir tarafında vahşi tiptir (WT), bu nedenle amaçlanan knock-in (KI) aleli tespit edilirse, WT / KI heterozigotturlar. Bu nedenle, hedefteki mutajenez, nispeten hızlı bir yaşam döngüsüne sahip olan ve üretken bir hayvan olan laboratuvar faresinde kritik bir sorun değildir. Bununla birlikte, bu teknoloji nispeten büyük memelilere uygulandığında daha fazla iyileştirme gerekli olacaktır.
Bu teknolojinin C57BL / 6J dışındaki inbred suşlarda gen kaseti knock-in fareleri üretebileceği doğrulanmıştır, ancak yeterli sayıda proje güvence altına alınmamıştır ve veriler oldukça değişkendir. Bu nedenle bu bilgiler bu çalışmada yer almamaktadır. Fare genetiği ve hastalık modeli araştırmalarını ilerletmek için bu konuda daha fazla çalışmanın gerekli olacağına inanılmaktadır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı’ndan Bilimsel Araştırma (B) (19H03142: SM’ye), Bilimsel Araştırma (A) (20H00444: FS’ye), Bilimsel Araştırma (A) (21H04838: SM’ye) ve Yenilikçi Alanlar Üzerine Bilimsel Araştırma “İleri Hayvan Modeli Destek Platformu” (16H06276: ST’ye) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makale hazırlamada hiçbir rolü yoktu. Ryoichi Mori’ye genom düzenleme tasarımı hakkındaki yararlı tartışması için minnettarız.
Materials
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | – | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | – | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | – | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | – | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | – |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
