מיקרו-הזרקה של זיגוטה ליצירת קלטות גנטיות ואללים של פלוקס בעכברים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מיקרו-הזרקה של זיגוטה של CRISPR-Cas9 ודנ”א של תורם כדי לייצר ביעילות קלטות גנים ועכברים פלוקסים.
Abstract
טכנולוגיית CRISPR-Cas אפשרה ייצור מהיר וללא מאמץ של עכברים מהונדסים גנטית. באופן ספציפי, עכברים ועכברים מוטנטיים נקודתיים מיוצרים בקלות על ידי אלקטרופורציה של גורמי קריספר (ותורמי דנ”א אוליגו חד-גדילי) לתוך הזיגוטה . לעומת זאת, קלטות גנים (>1 קילובייט) ועכברים פלוקסים נוצרים בעיקר על ידי מיקרו-הזרקה של פקטורי קריספר ותורמי דנ”א דו-גדילי לתוך זיגוטים. טכנולוגיות עריכת גנום גם הגדילו את הגמישות של ייצור עכברים מהונדסים גנטית. כעת ניתן להציג את המוטציות המיועדות באזורים הגנומיים של היעד במספר זני עכברים מולדים מועילים. הצוות שלנו ייצר יותר מ-200 קווי עכברים של קלטות גנטיות, ויותר מ-110 קווי עכברים מפוצצים על ידי מיקרו-הזרקה של CRISPR-Cas9 באמצעות זיגוטה בעקבות בקשות ממספר מדינות, כולל יפן. חלק מעריכת הגנום הזו השתמשה בזנים BALB/c, C3H/HeJ ו-C57BL/6N, אולם רובם השתמשו בזנים C57BL/6J. בניגוד לשיטת האלקטרופורציה, עריכת גנום על ידי מיקרו-הזרקה של זיגוטה בזנים שונים של עכברים אינה קלה כל כך. עם זאת, קלטות גנטיות ועכברים פלוקסים על רקע גנטי יחיד הם קריטיים כמו מודלים של האנשה גנטית, כתב פלואורסצנטי ועכבר נוקאאוט מותנה. לכן, מאמר זה מציג את הפרוטוקול למיקרו-הזרקה של זיגוטה של פקטורי CRISPR ותורמי DNA דו-גדילי בעכברי C57BL/6J ליצירת קלטות גנים ועכברים פלוקסד. מאמר זה מתמקד אך ורק בהזרקה גרעינית ולא בהזרקה ציטופלזמית. בנוסף למיקרו-הזרקה של זיגוטה, אנו מתווים את ציר הזמן לתהליך הייצור וטכניקות היקפיות כגון השראת ביוץ והחזרת עוברים.
Introduction
עכברי נוק-אין, שבהם הגנים האקסוגניים המיועדים מוצגים במוקד המטרה, נמצאים בשימוש נרחב במחקרי in vivo רבים כמו עכברים אנושיים גנטיים, עכברי כתב פלואורסצנטי ועכברי נהג Cre 1,2. כאשר מוטציות נוק-אין נגרמות על ידי עריכת גנום בזיגוטה של עכברים, דנ”א חד-גדילי (תורמי דנ”א אוליגו חד-גדילי, ssODN) או דנ”א דו-גדילי (dsDNA) משמש כדנ”א תורם 2,3. ssODN משמש בעיקר כדי לדפוק מקטעי גנים קצרים יחסית של פחות מ 200 bp4. ניתן לדפוק מקטעים ארוכים יותר מ 1 kb DNA באמצעות ssODN ארוך (lsODN)5,6, אולם הכנתם גוזלת זמן. כאשר משתמשים בתורמי dsDNA, ניתן ליצור קלטות גנטיות (>1 קילובייט) עכברים ללא הכנת DNA מייגעת של התורם7.
היתרון העיקרי של שימוש ב- ssODN הוא שאלקטרופורציה8 יכולה ליצור עכברי דפיקה. עם זאת, תורמי dsDNA חייבים להיות מוכנסים ישירות לתוך הגרעין על ידי מיקרו-הזרקה של זיגוטה. נדרשת נוק-אין סימולטני בשני אתרים כדי ליצור עכברים פלוקסים, שבהם כל רצף loxP נדפק במעלה ובמורד הזרם של גן המטרה. ישנן שתי דרכים ליצור עכברים floxed על ידי עריכת גנום בזיגוטה של עכבר – באמצעות שני ssODN עצמאיים, שכל אחד מהם נושא אתר loxP יחיד, או באמצעות dsDNA יחיד (או lsDNA) עם רצף floxed; הראשון מאוד לא יעיל 9,10,11. עריכת גנום באמצעות תורמי dsDNA היא הגישה הפשוטה ביותר לייצר קלטות גנים ועכברים פלוקסים אם הסביבה תורמת למיקרו-הזרקה של זיגוטה.
בתחילה, תערובות של Cas9 mRNA ו-sgRNA או וקטורים של DNA המקודדים sgRNA ו-Cas9 משמשות לעריכת גנום בזיגוטה של עכברים12,13. מכיוון שחלבוני Cas9 איכותיים ויציבים זמינים כעת בעלות נמוכה, הכנסת crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonucleoprotein (RNP) לזיגוטה14 של עכבר הפכה פופולרית. לאחרונה, עכברי נוק-אין נוצרו ביעילות גבוהה על ידי החדרת crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP ודנ”א תורם לשני גרעיני הזיגוטה של עכברים בשלב מחזור התא שבו סביר להניח שתתרחשדפיקה 15. לכן, הפרוטוקול הנוכחי מתאר טכניקות לייצור סוגים שונים של עכברי דפיקה בשיטה זו.
ישנם זנים רבים ושימושיים של עכברי מעבדה16. שינוי גנטי בתוך הרקע המולד, יכול להתעלם מהשפעת הרקע הגנטי על הפנוטיפ. מאמר זה מתאר שיטה לגרימת קלטות גנטיות ומוטציות floxed בזיגוטה של קו העכבר הנפוץ ביותר, C57BL/6J17. יתר על כן, ציר הזמן ליצירת עכברים מהונדסים גנטית והטכניקות ההיקפיות המשמשות נדונים גם, כולל השראת ביוץ והחזרת עוברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר הנוכחי, זיגוטות עכבר C57BL/6J טריות (לא קפואות-מופשרות), שהתקבלו מהזדווגות טבעית, שימשו לייצור עכברים לעריכת גנום. על ידי הזרקת crRNA-tracrRNA-Cas9 ודנ”א תורם (RNPD) לשני הגרעינים של זיגוטים אלה בשלב מחזור התא שבו סביר ביותר שתתרחש, נוצרו קלטות גנים ועכברים עם שיעור ילודה גבוה ויעילות מספקת בעריכת גנום. המחקר הנוכחי מחזק את יכולת ההרחבה של שיטת SPRINT-CRISPR15, שם היא מבטיחה יעילות מספקת אפילו ברקע הגנטי C57BL/6J, וניתן ליישם אותה בייצור עכברים פלוקסיים.
אלקטרופורציה היא שיטה כללית ביותר לייצור עכברים ערוכים בגנום בגלל העלות הנמוכה של מכשירי הניסוי והקלות של לימוד הטכניקה8. יתר על כן, שיטת i-GONAD19, שבה עריכת גנום נעשית עם עוברים טרום השרשה הקיימים באובידוקט, אינה דורשת עכבר מושתל. בהשוואה לשיטות אלה, השיטה הנוכחית המוצגת כאן היא יקרה וגוזלת זמן בעת הכנה ותחזוקה של סביבת ניסוי הן מבחינת חומרה והן מבחינת תוכנה. עם זאת, לאחר הקמת מתקני הניסוי, ניתן לייצר קלטות גנים מורכבות ועכברים פלוקסים עם רכיבי CRISPR הזמינים מסחרית בלבד (crRNA, tracrRNA וחלבון Cas9) וכמות פשוטה וקטנה של וקטור פלסמיד מעגלי שישמש כדנ”א תורם. משמעות הדבר היא שניתן לייצר קווי עכברים מורכבים רבים הערוכים בגנום ללא צורך בהכנה של lsODN 5,6 או וקטורי וירוס הקשורים לאדנו20 כדי להכין.
בניגוד לשיטת SPRINT-CRISPR15 המקורית, נעשה שימוש בזיגוטה טרייה (קפואה-מופשרת). כאשר משיגים זיגוטים טריים על ידי הזדווגות טבעית, ניתן להתעלם מהטעויות הטכניות שעלולות להתרחש במהלך הפריה חוץ גופית או הקפאה והפשרה. כמו כן, תהליך המניפולציה של העובר יכול להסתיים תוך כחצי יום (איור 1) בעקבות הגישה הנוכחית. מצד שני, כמה מגבלות של השיטה הנוכחית כוללות את הדרישה של עכברים זכרים רבים, שליטה רופפת על תזמון ההפריה, ואת היכולת המוגבלת לחזות לחלוטין את מספר הזיגוטה עבור מיקרו-הזרקה. בהשוואה לשיטת SPRINT-CRISPR המקורית, ייתכן שלשיטה זו יש שיעור ילודה גבוה יותר (טבלה 1). למרות זאת, לא ניתן להסיק כי השיטה הנוכחית טובה יותר מבחינת שיעור הילודה בגלל ההבדלים במוליכי הניסוי, גני המטרה, הרקע הגנטי ועיתוי אישור העוברים.
כפי שניתן לראות בטבלה 1, למספר גדול של עכברים ברוב פרויקטי ההקלטות של הגנים היו אללי אינטגרציה אקראיים. אינטגרציה אקראית חייבת להימחק מכיוון שהיא עלולה להוביל לשיבוש לא מכוון של גנים אנדוגניים ולביטוי חוץ רחמי של טרנסגנים. האתגר לעתיד הוא למצוא תנאי ניסוי שיפחיתו את מספר אירועי האינטגרציה האקראיים תוך שמירה על יעילות מספקת של התקיפה.
כמעט כל עריכה גנומית של זיגוטה בעכבר באמצעות אפקטים של עריכת גנום הגורמים לשברים דו-גדיליים של DNA עשויה לגרום למוטציות לא מכוונות באתרי היעד 9,21. התוצאות של מוטציות מטרה לא מכוונות אלה אינן מתוארות כאן, משום שאיננו נמצאים במצב שבו ניתן לנהל את הדור הבא של עכברים כדי להציג ראיות ברורות לקיומן. הדרך הטובה ביותר לשלול את החשש מבלבול הנגרם על ידי מוטגנזה לא מכוונת על המטרה היא להשיג את הדור הבא של עכברים על ידי הזדווגות מייסדים עם עכברי בר במקום להצליב מייסדים. באופן עקרוני, עכברי N1 הנובעים מצלב זה הם מסוג פרא (WT) בצד אחד של האלל, כך שאם מתגלה אלל הנוק-אין המיועד (KI), הם הטרוזיגוטים מסוג WT/KI. לכן, מוטגנזה על המטרה אינה בעיה קריטית בעכבר המעבדה, שיש לו מחזור חיים מהיר יחסית והוא חיה פורייה. עם זאת, שיפור נוסף יהיה צורך כאשר טכנולוגיה זו מיושמת על יונקים גדולים יחסית.
אושר כי טכנולוגיה זו יכולה לייצר קלטות גנטיות בעכברים בזנים מולדים שאינם C57BL/6J, אך מספר מספיק של פרויקטים אינם מאובטחים, והנתונים משתנים מאוד. מסיבה זו, מידע זה אינו נכלל במחקר הנוכחי. ההערכה היא כי יהיה צורך במחקרים נוספים בנושא זה כדי לקדם את הגנטיקה של העכבר ואת מחקר מודל המחלה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מחקר מדעי (B) (19H03142: ל- SM), מחקר מדעי (A) (20H00444: ל- FS), מחקר מדעי (A) (21H04838: ל- SM), ומחקר מדעי בתחומים חדשניים “פלטפורמה לתמיכה מתקדמת במודלים של בעלי חיים” (16H06276: ל- ST) ממשרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתבי היד. אנו אסירי תודה לריואיצ’י מורי על הדיון המועיל שלו על עיצוב עריכת גנום.
Materials
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | – | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | – | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | – | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | – | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | – |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
