Het huidige protocol beschrijft zygote micro-injectie van CRISPR-Cas9 en donor-DNA om efficiënt gencassette knock-in en floxed muizen te produceren.
CRISPR-Cas-technologie heeft de snelle en moeiteloze generatie van genetisch gemodificeerde muizen mogelijk gemaakt. In het bijzonder worden muizen en puntmutante muizen gemakkelijk geproduceerd door elektroporatie van CRISPR-factoren (en enkelstrengs oligo-DNA-donoren) in de zygote. Daarentegen worden gencassette (>1 kb) knock-in en floxed muizen voornamelijk gegenereerd door micro-injectie van CRISPR-factoren en dubbelstrengs DNA-donoren in zygoten. Genoombewerkingstechnologieën hebben ook de flexibiliteit van de productie van genetisch gemodificeerde muizen vergroot. Het is nu mogelijk om de beoogde mutaties in de doelgenomische regio’s te introduceren in een aantal gunstige inteeltstammen van muizen. Ons team heeft meer dan 200 gencassette knock-in muislijnen geproduceerd, en meer dan 110 floxed muislijnen door zygote microinjectie van CRISPR-Cas9 na verzoeken van verschillende landen, waaronder Japan. Sommige van deze genoombewerking gebruikten BALB / c, C3H / HeJ en C57BL / 6N inteeltstammen, maar de meeste gebruikten C57BL / 6J. In tegenstelling tot de elektroporatiemethode is genoombewerking door zygote micro-injectie in verschillende inteeltstammen van muizen niet zo eenvoudig. Gencassette knock-in en floxed muizen op enkele inteelt genetische achtergronden zijn echter net zo kritisch als genetisch gehumaniseerde, fluorescerende reporter en voorwaardelijke knock-out muismodellen. Daarom presenteert dit artikel het protocol voor de zygote micro-injectie van CRISPR-factoren en dubbelstrengs DNA-donoren in C57BL / 6J-muizen voor het genereren van gencassette knock-in en floxed muizen. Dit artikel richt zich uitsluitend op nucleaire injectie in plaats van cytoplasmatische injectie. Naast zygote micro-injectie schetsen we de tijdlijn voor het productieproces en perifere technieken zoals inductie van superovulatie en embryotransfer.
Knock-in muizen, waarbij de beoogde exogene genen worden geïntroduceerd op de doelloci, worden veel gebruikt in veel in vivo studies als gengehumaniseerde muizen, fluorescerende reportermuizen en Cre driver-muizen 1,2. Wanneer knock-in mutaties worden geïnduceerd door genoombewerking in muiszygoten, wordt enkelstrengs DNA (enkelstrengs oligo-DNA-donoren, ssODN) of dubbelstrengs DNA (dsDNA) gebruikt als donor-DNA 2,3. ssODN wordt voornamelijk gebruikt om relatief korte genfragmenten van minder dan 200 bp4 in te kloppen. Het is mogelijk om fragmenten langer dan 1 kb DNA in te kloppen met behulp van lange ssODN’s (lsODN)5,6, maar hun voorbereiding is tijdrovend. Wanneer dsDNA-donoren worden gebruikt, kunnen gencassette (>1 kb) knock-in muizen worden gegenereerd zonder moeizame donor-DNA-voorbereiding7.
Het belangrijkste voordeel van het gebruik van ssODN’s is dat elektroporatie8 knock-in muizen kan genereren. DsDNA-donoren moeten echter rechtstreeks in de kern worden ingebracht door middel van zygote micro-injectie. Gelijktijdige knock-in op twee locaties is vereist om floxed muizen te creëren, waarbij elke loxP-sequentie stroomopwaarts en stroomafwaarts van het doelgen wordt ingeklopt. Er zijn twee manieren om floxed muizen te genereren door genoombewerking in muis zygoten – met behulp van twee onafhankelijke ssODNs, elk met een enkele loxP-site, of met behulp van een enkele dsDNA (of lsDNA) met een floxed sequentie; De eerste is zeer inefficiënt 9,10,11. Genoombewerking met behulp van dsDNA-donoren is de eenvoudigste aanpak om gencassette knock-in en floxed muizen te produceren als de omgeving bevorderlijk is voor zygote micro-injectie.
In eerste instantie worden mengsels van Cas9-mRNA en sgRNA of DNA-vectoren die coderen voor sgRNA en Cas9 gebruikt voor genoombewerking in muiszygoten12,13. Omdat hoogwaardige en stabiele Cas9-eiwitten nu tegen lage kosten beschikbaar zijn, is de introductie van crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonucleoproteïne (RNP) in muiszygoten14 populair geworden. Onlangs zijn knock-in muizen met hoge efficiëntie gegenereerd door het introduceren van het crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP en donor-DNA in beide pronuclei van muis zygoten in een celcyclusfase waar knock-in het meest waarschijnlijk is15. Daarom beschrijft het huidige protocol technieken voor het produceren van verschillende soorten knock-in muizen door deze methode.
Er zijn veel nuttige inteeltstammen van laboratoriummuizen16. Genetische modificatie binnen de inteeltachtergrond kan de invloed van genetische achtergrond op het fenotype buiten beschouwing laten. Dit artikel beschrijft een methode voor het induceren van gencassette knock-in en floxed mutaties in de zygote van de meest gebruikte inteelt muizenlijn, de C57BL/6J17. Verder worden ook de tijdlijn voor het genereren van genetisch gemodificeerde muizen en de gebruikte perifere technieken besproken, waaronder de inductie van superovulatie en embryotransfer.
In de huidige studie werden verse (niet bevroren-ontdooide) C57BL/6J muiszygoten, verkregen uit natuurlijke paring, gebruikt voor de productie van genoombewerkingsmuizen. Door crRNA-tracrRNA-Cas9 en donor-DNA (RNPD) in beide pronuclei van deze zygoten te injecteren in een celcyclusfase waar knock-in het meest waarschijnlijk is, werden gencassette knock-in en floxed muizen gegenereerd met een hoog geboortecijfer en voldoende genoombewerkingsefficiëntie. De huidige studie versterkt de uitbreidbaarheid van de SPRINT-CRISPR-methode15, waar het zorgt voor voldoende knock-in efficiëntie, zelfs in de C57BL / 6J genetische achtergrond, en kan worden toegepast op de productie van floxed muizen.
Elektroporatie is een zeer gegeneraliseerde methode voor het produceren van genoom-bewerkte muizen vanwege de lage kosten van de experimentele apparaten en het gemak van het leren van de techniek8. Bovendien is voor de i-GONAD-methode19, waarbij genoombewerking wordt uitgevoerd met pre-implantatie-embryo’s die in de eileider aanwezig zijn, geen ontvangende muis nodig. In vergelijking met deze methoden is de hier gepresenteerde methode kostbaar en tijdrovend bij het voorbereiden en onderhouden van een experimentele omgeving in termen van zowel hardware als software. Zodra de experimentele faciliteiten zijn opgezet, kunnen echter complexe gencassette knock-in en floxed muizen worden geproduceerd met alleen commercieel beschikbare CRISPR-elementen (crRNA, tracrRNA en Cas9-eiwit) en een eenvoudige, kleine hoeveelheid circulaire plasmidevector om te worden gebruikt als donor-DNA. Dit betekent dat veel complexe genoom-bewerkte muislijnen kunnen worden geproduceerd zonder de noodzaak van tijdrovende (of relatief dure) lsODN 5,6 of adeno-geassocieerde virusvectoren20 om voor te bereiden.
In tegenstelling tot de oorspronkelijke SPRINT-CRISPR-methode15 werden verse (bevroren-ontdooide) zygoten gebruikt. Bij het verkrijgen van verse zygoten door natuurlijke paring kunnen de technische fouten worden genegeerd die kunnen optreden tijdens in-vitrofertilisatie of invriezen en ontdooien. Ook kan het embryomanipulatieproces in ongeveer een halve dag worden voltooid (figuur 1) volgens de huidige aanpak. Aan de andere kant zijn enkele beperkingen van de huidige methode de vereiste van veel mannelijke muizen, de losse controle over de bevruchtingstiming en het beperkte vermogen om het aantal zygoten voor micro-injectie volledig te voorspellen. In vergelijking met de oorspronkelijke SPRINT-CRISPR-methode kan deze methode een hoger geboortecijfer hebben (tabel 1). Desondanks kan niet worden geconcludeerd dat de huidige methode beter is in termen van geboortecijfer vanwege de verschillen in de experimentgeleiders, doelgenen, genetische achtergronden en timing van embryobevestiging.
Zoals te zien is in tabel 1, had een groot aantal muizen in de meeste gencassette knock-in projecten willekeurige integratie allelen. Willekeurige integratie moet worden geëlimineerd omdat het kan leiden tot onbedoelde verstoring van endogene genen en ectopische expressie van transgenen. De uitdaging voor de toekomst is om experimentele omstandigheden te vinden die het aantal willekeurige integratiegebeurtenissen verminderen met behoud van voldoende knock-in efficiëntie.
Bijna alle zygote genoombewerking van muizen met behulp van genoombewerkingseffectoren die resulteren in DNA-dubbelstrengsbreuken zal waarschijnlijk onbedoelde mutaties veroorzaken op on-target locaties 9,21. De resultaten van deze onbedoelde on-target mutaties worden hier niet beschreven omdat we ons niet in een situatie bevinden waarin de volgende generatie muizen kan worden beheerd om duidelijk bewijs van hen te presenteren. De beste manier om de bezorgdheid over verwarring veroorzaakt door onbedoelde on-target mutagenese uit te sluiten, is om de volgende generatie muizen te verkrijgen door oprichters te paren met wildtype muizen in plaats van oprichters te kruisen. In principe zijn de N1-muizen die het resultaat zijn van deze kruising wild-type (WT) aan één kant van het allel, dus als het beoogde knock-in (KI) allel wordt gedetecteerd, zijn ze WT / KI heterozygoot. Daarom is de on-target mutagenese geen kritiek probleem bij de laboratoriummuis, die een relatief snelle levenscyclus heeft en een productief dier is. Verdere verbetering zal echter nodig zijn wanneer deze technologie wordt toegepast op relatief grote zoogdieren.
Er is bevestigd dat deze technologie gencassette knock-in muizen kan produceren in andere inteeltstammen dan C57BL / 6J, maar een voldoende aantal projecten is niet beveiligd en de gegevens zijn zeer variabel. Om deze reden is deze informatie niet opgenomen in deze studie. Er wordt aangenomen dat verdere studies over dit onderwerp nodig zullen zijn om het onderzoek naar muizengenetica en ziektemodellen te bevorderen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door Wetenschappelijk Onderzoek (B) (19H03142: naar SM), Wetenschappelijk Onderzoek (A) (20H00444: naar FS), Wetenschappelijk Onderzoek (A) (21H04838: naar SM), en Wetenschappelijk Onderzoek naar Innovatieve Gebieden “Platform of Advanced Animal Model Support” (16H06276: naar ST) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van manuscripten. We zijn Ryoichi Mori dankbaar voor zijn nuttige discussie over genoombewerkingsontwerp.
Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
crRNA | IDT | – | |
Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
hCG | ASKA Animal Health | – | |
Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
Inverted microscope | Leica | ||
KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
Medetomidine | ZENOAQ | – | |
Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
Micromanipulator units | Narishige | ||
Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
PMSG | ASKA Animal Health | – | |
Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
RNase | QIAGEN | 19101 | |
RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
tracrRNA | IDT | – |