Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi
Summary
Il presente protocollo descrive la microiniezione di zigote di CRISPR-Cas9 e DNA del donatore per produrre in modo efficiente topi knock-in e floxed con cassette geniche.
Abstract
La tecnologia CRISPR-Cas ha permesso la generazione rapida e senza sforzo di topi geneticamente modificati. In particolare, topi e topi mutanti puntiformi sono prontamente prodotti dall’elettroporazione di fattori CRISPR (e donatori di DNA oligo a singolo filamento) nello zigote. Al contrario, i topi knock-in e floxed con cassetta genica (>1 kb) sono generati principalmente dalla microiniezione di fattori CRISPR e donatori di DNA a doppio filamento negli zigoti. Le tecnologie di modifica del genoma hanno anche aumentato la flessibilità della produzione di topi geneticamente modificati. È ora possibile introdurre le mutazioni previste nelle regioni genomiche bersaglio in una serie di ceppi di topi inbred benefici. Il nostro team ha prodotto oltre 200 linee di topi knock-in su cassetta genetica e oltre 110 linee di topi floxed mediante microiniezione di zigote di CRISPR-Cas9 a seguito di richieste da diversi paesi, incluso il Giappone. Alcuni di questi editing del genoma utilizzavano ceppi inbred BALB/c, C3H/HeJ e C57BL/6N, tuttavia la maggior parte utilizzava C57BL/6J. A differenza del metodo di elettroporazione, l’editing del genoma mediante microiniezione di zigote in vari ceppi consanguinei di topi non è così facile. Tuttavia, i topi knock-in e floxed su singoli background genetici inbred sono critici quanto i modelli murini genetici umanizzati, fluorescenti e knockout condizionali. Pertanto, questo articolo presenta il protocollo per la microiniezione di zigote di fattori CRISPR e donatori di DNA a doppio filamento in topi C57BL / 6J per la generazione di topi knock-in e floxed con cassette geniche. Questo articolo si concentra esclusivamente sull’iniezione nucleare piuttosto che sull’iniezione citoplasmatica. Oltre alla microiniezione di zigote, delineiamo la tempistica per il processo di produzione e le tecniche periferiche come l’induzione della superovulazione e il trasferimento di embrioni.
Introduction
I topi knock-in, in cui i geni esogeni previsti vengono introdotti nei loci bersaglio, sono ampiamente utilizzati in molti studi in vivo come topi umanizzati dal gene, topi reporter fluorescenti e topi driver Cre 1,2. Quando le mutazioni knock-in sono indotte dall’editing del genoma negli zigoti di topo, il DNA a singolo filamento (donatori di DNA oligo a singolo filamento, ssODN) o DNA a doppio filamento (dsDNA) viene utilizzato come DNA donatore 2,3. ssODN è usato principalmente per eliminare frammenti genetici relativamente corti inferiori a 200 bp4. È possibile inserire frammenti più lunghi di 1 kb di DNA usando ssODN lunghi (lsODN)5,6, tuttavia la loro preparazione richiede molto tempo. Quando vengono utilizzati donatori di dsDNA, è possibile generare topi knock-in con cassetta genica (>1 kb) senza laboriosa preparazione del DNA del donatore7.
Il vantaggio principale dell’utilizzo di ssODN è che l’elettroporazione8 può generare topi knock-in. Tuttavia, i donatori di dsDNA devono essere introdotti direttamente nel nucleo mediante microiniezione di zigote. Il knock-in simultaneo in due siti è necessario per creare topi floxed, in cui ogni sequenza loxP viene eliminata a monte e a valle del gene bersaglio. Ci sono due modi per generare topi floxati mediante l’editing del genoma negli zigoti di topo: usando due ssODN indipendenti, ciascuno con un singolo sito loxP, o usando un singolo dsDNA (o lsDNA) con una sequenza floxata; Il primo è molto inefficiente 9,10,11. L’editing del genoma utilizzando donatori di dsDNA è l’approccio più semplice per produrre topi knock-in e floxed con cassette geniche se l’ambiente è favorevole alla microiniezione di zigote.
Inizialmente, miscele di Cas9 mRNA e sgRNA o vettori DNA che codificano sgRNA e Cas9 sono utilizzati per l’editing del genoma negli zigoti di topo12,13. Poiché le proteine Cas9 stabili e di alta qualità sono ora disponibili a basso costo, l’introduzione della ribonucleoproteina crRNA-tracrRNA-Cas9 (RNP) negli zigoti di topo14 è diventata popolare. Recentemente, topi knock-in sono stati generati con elevata efficienza introducendo il crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP e il DNA del donatore in entrambi i pronuclei degli zigoti di topo in una fase del ciclo cellulare in cui è più probabile che si verifichi knock-in15. Pertanto, il presente protocollo descrive le tecniche per produrre vari tipi di topi knock-in con questo metodo.
Ci sono molti ceppi inbred utili di topi da laboratorio16. La modificazione genetica all’interno del background inbred può ignorare l’influenza del background genetico sul fenotipo. Questo articolo descrive un metodo per indurre mutazioni knock-in e floxed nella cassetta genica dello zigote della linea di topi inbred più comunemente usata, il C57BL/6J17. Inoltre, vengono discussi anche i tempi per la generazione di topi geneticamente modificati e le tecniche periferiche utilizzate, compresa l’induzione della superovulazione e il trasferimento di embrioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel presente studio, zigoti di topo C57BL / 6J freschi (non congelati-scongelati), ottenuti dall’accoppiamento naturale, sono stati utilizzati per la produzione di topi di editing del genoma. Iniettando crRNA-tracrRNA-Cas9 e DNA donatore (RNPD) in entrambi i pronuclei di questi zigoti in una fase del ciclo cellulare in cui è più probabile che si verifichi knock-in, sono stati generati topi knock-in e floxed con un alto tasso di natalità e una sufficiente efficienza di editing del genoma. L’attuale studio rafforza l’estensibilità del metodo SPRINT-CRISPR15, dove garantisce una sufficiente efficienza knock-in anche nel background genetico C57BL / 6J e può essere applicato alla produzione di topi floxed.
L’elettroporazione è un metodo altamente generalizzato per produrre topi modificati dal genoma a causa del basso costo dei dispositivi sperimentali e della facilità di apprendimento della tecnica8. Inoltre, il metodo i-GONAD19, in cui l’editing del genoma viene eseguito con embrioni preimpianto esistenti nell’ovidotto, non richiede un topo ricevente. Rispetto a questi metodi, il metodo attuale qui presentato è costoso e richiede tempo quando si prepara e si mantiene un ambiente sperimentale in termini sia di hardware che di software. Tuttavia, una volta che le strutture sperimentali sono state istituite, complessi topi knock-in e floxed possono essere prodotti con solo elementi CRISPR disponibili in commercio (crRNA, tracrRNA e proteina Cas9) e una semplice, piccola quantità di vettore plasmidico circolare da utilizzare come DNA donatore. Ciò significa che molte linee di topi complessi modificati dal genoma possono essere prodotte senza la necessità di lunghi (o relativamente costosi) lsODN 5,6 o di vettori virali adeno-associati20 per prepararsi.
A differenza del metodo originale SPRINT-CRISPR15, sono stati utilizzati zigoti freschi (congelati-scongelati). Quando si ottengono zigoti freschi mediante accoppiamento naturale, gli errori tecnici possono essere ignorati che possono verificarsi durante la fecondazione in vitro o il congelamento e lo scongelamento. Inoltre, il processo di manipolazione embrionale può essere completato in circa mezza giornata (Figura 1) seguendo l’approccio attuale. D’altra parte, alcune limitazioni del presente metodo includono il requisito di molti topi maschi, il controllo allentato dei tempi di fecondazione e la limitata capacità di prevedere completamente il numero di zigoti per la microiniezione. Rispetto al metodo originale SPRINT-CRISPR, questo metodo può avere un tasso di natalità più elevato (Tabella 1). Nonostante ciò, non si può concludere che il metodo attuale sia migliore in termini di tasso di natalità a causa delle differenze nei conduttori dell’esperimento, nei geni bersaglio, nei background genetici e nei tempi di conferma dell’embrione.
Come mostrato nella Tabella 1, un gran numero di topi nella maggior parte dei progetti di knock-in della cassetta genica avevano alleli di integrazione casuali. L’integrazione casuale deve essere eliminata perché può portare a interruzioni non intenzionali dei geni endogeni e all’espressione ectopica dei transgeni. La sfida per il futuro è trovare condizioni sperimentali che riducano il numero di eventi di integrazione casuali pur mantenendo un’efficienza knock-in sufficiente.
Quasi tutto l’editing del genoma dello zigote di topo che utilizza effettori di editing del genoma che provocano rotture del doppio filamento del DNA è probabile che induca mutazioni non intenzionali nei siti bersaglio 9,21. I risultati di queste mutazioni non intenzionali sul bersaglio non sono descritti qui perché non siamo in una situazione in cui la prossima generazione di topi può essere gestita al fine di presentare prove chiare di loro. Il modo migliore per escludere la preoccupazione di confusione causata da mutagenesi non intenzionale sul bersaglio è quello di ottenere la prossima generazione di topi accoppiando i fondatori con topi wild-type piuttosto che incrociare i fondatori. In linea di principio, i topi N1 risultanti da questo incrocio sono wild-type (WT) su un lato dell’allele, quindi se viene rilevato l’allele knock-in (KI) previsto, sono eterozigoti WT / KI. Pertanto, la mutagenesi on-target non è un problema critico nel topo da laboratorio, che ha un ciclo di vita relativamente veloce ed è un animale prolifico. Tuttavia, saranno necessari ulteriori miglioramenti quando questa tecnologia sarà applicata a mammiferi relativamente grandi.
È stato confermato che questa tecnologia può produrre topi knock-in con cassette geniche in ceppi inbred diversi da C57BL/6J, ma un numero sufficiente di progetti non è protetto e i dati sono altamente variabili. Per questo motivo, queste informazioni non sono incluse nel presente studio. Si ritiene che saranno necessari ulteriori studi su questo argomento per far progredire la genetica dei topi e la ricerca sui modelli di malattia.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla ricerca scientifica (B) (19H03142: a SM), dalla ricerca scientifica (A) (20H00444: da FS), dalla ricerca scientifica (A) (21H04838: da SM) e dalla ricerca scientifica su aree innovative “Platform of Advanced Animal Model Support” (16H06276: a ST) del Ministero dell’istruzione, della cultura, dello sport, della scienza e della tecnologia. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto. Siamo grati a Ryoichi Mori per la sua utile discussione sulla progettazione dell’editing del genoma.
Materials
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | – | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | – | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | – | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | – | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | – |
References
- Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
- Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
- Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
- Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
- Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
- Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
- Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
- Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
- Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
- Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
- Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
- Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
- Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
- Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
- Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
- Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
- Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
- Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
- Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).
