Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones
Summary
El presente protocolo describe la microinyección de cigoto de CRISPR-Cas9 y ADN de donantes para producir eficientemente ratones knock-in y floxed de casetes de genes.
Abstract
La tecnología CRISPR-Cas ha permitido la generación rápida y sin esfuerzo de ratones modificados genéticamente. Específicamente, los ratones y ratones mutantes puntuales se producen fácilmente mediante electroporación de factores CRISPR (y donantes de oligoADN monocatenario) en el cigoto. Por el contrario, los ratones knock-in y floxed de casete de genes (>1 kb) se generan principalmente mediante microinyección de factores CRISPR y donantes de ADN bicatenario en cigotos. Las tecnologías de edición del genoma también han aumentado la flexibilidad de la producción de ratones modificados genéticamente. Ahora es posible introducir las mutaciones previstas en las regiones genómicas objetivo en una serie de cepas de ratones endogámicos beneficiosos. Nuestro equipo ha producido más de 200 líneas de ratones knock-in de casetes genéticos y más de 110 líneas de ratón floxed mediante microinyección de cigoto de CRISPR-Cas9 siguiendo las solicitudes de varios países, incluido Japón. Algunas de estas ediciones genómicas utilizaron cepas endogámicas BALB/c, C3H/HeJ y C57BL/6N, sin embargo, la mayoría utilizó C57BL/6J. A diferencia del método de electroporación, la edición del genoma por microinyección de cigoto en varias cepas endogámicas de ratones no es tan fácil. Sin embargo, los ratones knock-in y floxed de casetes de genes en fondos genéticos endogámicos individuales son tan críticos como los modelos de ratones genéticamente humanizados, reporteros fluorescentes y knockout condicionales. Por lo tanto, este artículo presenta el protocolo para la microinyección de cigoto de factores CRISPR y donantes de ADN bicatenario en ratones C57BL / 6J para generar ratones knock-in y floxed de casetes de genes. Este artículo se centra exclusivamente en la inyección nuclear en lugar de la inyección citoplasmática. Además de la microinyección de cigoto, describimos la línea de tiempo para el proceso de producción y las técnicas periféricas, como la inducción de la superovulación y la transferencia de embriones.
Introduction
Los ratones knock-in, en los que los genes exógenos previstos se introducen en los loci objetivo, son ampliamente utilizados en muchos estudios in vivo como ratones humanizados con genes, ratones reporteros fluorescentes y ratones conductores Cre 1,2. Cuando las mutaciones knock-in son inducidas por la edición del genoma en cigotos de ratón, el ADN monocatenario (donantes de oligo ADN monocatenario, ssODN) o el ADN bicatenario (dsDNA) se utiliza como ADN donante 2,3. ssODN se utiliza principalmente para golpear fragmentos de genes relativamente cortos de menos de 200 pb4. Es posible golpear fragmentos de más de 1 kb de ADN utilizando ssODNs largos (lsODN)5,6, sin embargo, su preparación requiere mucho tiempo. Cuando se utilizan donantes de dsDNA, se pueden generar ratones knock-in de casete de genes (>1 kb) sin una laboriosa preparación de ADN del donante7.
La principal ventaja de usar ssODNs es que la electroporación8 puede generar ratones knock-in. Sin embargo, los donantes de dsDNA deben introducirse directamente en el núcleo mediante microinyección de cigoto. Se requiere un knock-in simultáneo en dos sitios para crear ratones floxed, en los que cada secuencia loxP se golpea aguas arriba y aguas abajo del gen objetivo. Hay dos formas de generar ratones floxed mediante la edición del genoma en cigotos de ratón: utilizando dos ssODN independientes, cada uno con un solo sitio loxP, o usando un solo dsDNA (o lsDNA) con una secuencia floxed; El primero es muy ineficiente 9,10,11. La edición del genoma utilizando donantes de dsDNA es el enfoque más simple para producir ratones de cassette de genes knock-in y floxed si el entorno es propicio para la microinyección de cigoto.
Inicialmente, las mezclas de ARNm Cas9 y sgRNA o vectores de ADN que codifican sgRNA y Cas9 se utilizan para la edición del genoma en cigotos de ratón12,13. Dado que las proteínas Cas9 estables y de alta calidad ahora están disponibles a bajo costo, la introducción de crRNA-tracrRNA-Cas9 ribonucleoproteína (RNP) en cigotos de ratón14 se ha vuelto popular. Recientemente, se han generado ratones knock-in con alta eficiencia mediante la introducción del crRNA-tracrRNA-Cas9 RNP y ADN del donante en ambos pronúcleos de cigotos de ratón en una fase del ciclo celular donde es más probable que ocurraknock-in 15. Por lo tanto, el presente protocolo describe técnicas para producir varios tipos de ratones knock-in por este método.
Hay muchas cepas endogámicas útiles de ratones de laboratorio16. La modificación genética dentro del fondo endogámico puede ignorar la influencia de los antecedentes genéticos en el fenotipo. Este artículo describe un método para inducir mutaciones en el virus del cassette knock-in y floxed en el cigoto de la línea de ratones endogámicos más utilizada, la C57BL/6J17. Además, también se discute la línea de tiempo para la generación de ratones modificados genéticamente y las técnicas periféricas utilizadas, incluida la inducción de la superovulación y la transferencia de embriones.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el presente estudio, se utilizaron cigotos de ratón C57BL / 6J frescos (no congelados-descongelados), obtenidos del apareamiento natural, para la producción de ratones de edición del genoma. Al inyectar crRNA-tracrRNA-Cas9 y ADN del donante (RNPD) en ambos pronúcleos de estos cigotos en una fase del ciclo celular donde es más probable que ocurra knock-in, se generaron ratones knock-in y floxed con una alta tasa de natalidad y suficiente eficiencia de edición del genoma. El estudio actual refuerza la extensibilidad del método SPRINT-CRISPR15, donde garantiza una eficiencia de knock-in suficiente incluso en el fondo genético C57BL / 6J, y se puede aplicar a la producción de ratones floxed.
La electroporación es un método altamente generalizado de producción de ratones editados por genoma debido al bajo costo de los dispositivos experimentales y la facilidad de aprendizaje de la técnica8. Además, el método i-GONAD19, en el que la edición del genoma se realiza con embriones preimplantacionales existentes en el oviducto, no requiere un ratón receptor. En comparación con estos métodos, el método actual presentado aquí es costoso y requiere mucho tiempo cuando se prepara y mantiene un entorno experimental en términos de hardware y software. Sin embargo, una vez que se establecen las instalaciones experimentales, se pueden producir ratones complejos de cassette y floxed con solo elementos CRISPR disponibles comercialmente (crRNA, tracrRNA y proteína Cas9) y una cantidad simple y pequeña de vector plásmido circular para ser utilizado como ADN del donante. Esto significa que se pueden producir muchas líneas complejas de ratón editadas por el genoma sin la necesidad de lsODN 5,6 o vectores de virus adenoasociados20 que consumen mucho tiempo (o relativamente caros) para prepararse.
A diferencia del método SPRINT-CRISPR original15, se utilizaron cigotos frescos (congelados-descongelados). Al obtener cigotos frescos por apareamiento natural, se pueden ignorar los errores técnicos que pueden ocurrir durante la fertilización in vitro o la congelación y descongelación. Además, el proceso de manipulación del embrión se puede completar en aproximadamente medio día (Figura 1) siguiendo el enfoque actual. Por otro lado, algunas limitaciones del método actual incluyen el requisito de muchos ratones machos, el control laxo del momento de la fertilización y la capacidad limitada para predecir completamente el número de cigotos para la microinyección. En comparación con el método SPRINT-CRISPR original, este método puede tener una tasa de natalidad más alta (Tabla 1). A pesar de esto, no se puede concluir que el método actual sea mejor en términos de tasa de natalidad debido a las diferencias en los conductores del experimento, los genes objetivo, los antecedentes genéticos y el momento de la confirmación del embrión.
Como se muestra en la Tabla 1, un gran número de ratones en la mayoría de los proyectos de knock-in de casetes de genes tenían alelos de integración aleatorios. La integración aleatoria debe eliminarse porque puede conducir a la interrupción involuntaria de genes endógenos y la expresión ectópica de transgenes. El desafío para el futuro es encontrar condiciones experimentales que reduzcan el número de eventos de integración aleatorios mientras se mantiene una eficiencia de knock-in suficiente.
Casi toda la edición del genoma del cigoto del ratón utilizando efectores de edición del genoma que resultan en roturas de doble cadena de ADN es probable que induzca mutaciones no intencionales en los sitios objetivo 9,21. Los resultados de estas mutaciones no deseadas en el objetivo no se describen aquí porque no estamos en una situación en la que la próxima generación de ratones pueda ser manejada para presentar evidencia clara de ellas. La mejor manera de descartar la preocupación de confusión causada por la mutagénesis no intencional en el objetivo es obtener la próxima generación de ratones apareando a los fundadores con ratones de tipo salvaje en lugar de cruzar a los fundadores. En principio, los ratones N1 resultantes de este cruce son de tipo salvaje (WT) en un lado del alelo, por lo que si se detecta el alelo knock-in (KI) previsto, son heterocigotos WT/KI. Por lo tanto, la mutagénesis en el objetivo no es un problema crítico en el ratón de laboratorio, que tiene un ciclo de vida relativamente rápido y es un animal prolífico. Sin embargo, será necesario mejorar aún más cuando esta tecnología se aplique a mamíferos relativamente grandes.
Se ha confirmado que esta tecnología puede producir ratones knock-in de casete de genes en cepas endogámicas distintas de C57BL / 6J, pero no se asegura un número suficiente de proyectos y los datos son muy variables. Por esta razón, esta información no se incluye en el presente estudio. Se cree que serán necesarios más estudios sobre este tema para avanzar en la genética del ratón y la investigación de modelos de enfermedades.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por Investigación Científica (B) (19H03142: a SM), Investigación Científica (A) (20H00444: a FS), Investigación Científica (A) (21H04838: a SM) e Investigación Científica en Áreas Innovadoras “Plataforma de Apoyo a Modelos Animales Avanzados” (16H06276: a ST) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a Ryoichi Mori por su útil discusión sobre el diseño de edición del genoma.
Materials
| Atipamezole Hydrochloride | ZENOAQ | – | |
| Autoclip Wound Clip | BD | 427631 | |
| Autoclip Wound Clip Applier | BD | 427630 | |
| Butorphanol | Meiji Seika Pharma | – | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old |
| Calibrated Pipet, 100ul | Drummond Scientific Company | 2-000-100 | for collecting zygote and embryo transfer |
| Cas9 | Thermo Fisher Scientific | A36499 | |
| Cas9 Nuclease Reaction Buffer | NEB | B7203 | |
| CellTram 4r oil | Eppendorf | 5196000030 | |
| CRISPOR | http://crispor.tefor.net/ | web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system | |
| crRNA | IDT | – | |
| Gel/PCR Extraction Kit | FastGene | FG-91302 | |
| hCG | ASKA Animal Health | – | |
| Hyaluronidase | Merck Sigma-Aldrich | H3884 | |
| ICR mice | Jackson Laboratory Japan | – | older than 10 weeks old, weight 28 G or more |
| Inverted microscope | Leica | ||
| KOnezumi | https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html | a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice | |
| M16 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Merck Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Medetomidine | ZENOAQ | – | |
| Micro shears | Natsume Seisakusho | MB-54-1 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle |
| Micromanipulator units | Narishige | ||
| Micropipette puller | Sutter Instrument | P-1000 | programmable pipette puller |
| Midazolam | Maruishi Pharmaceutical | – | |
| MILLEX-GV 0.22 µm filter | Merck Millipore | SLGV033R | |
| Mineral oil | Nacalai | 26114-75 | for zygote culture and injection chamber |
| Petri dish (35mm, untreated) | Iwaki | 1000-035 | for zygote culture |
| PIEZO micromanipulator | PRIME TECH | PMM-150 | |
| Plasmid Mini Kit | FastGene | FG-90502 | mini prep spin column kit |
| PMM Operation Liquid | PRIME TECH | KIT-A | operation liquid for microinjection |
| PMSG | ASKA Animal Health | – | |
| Polyvinylpyrrolidone | Merck Sigma-Aldrich | P5288 | |
| RNase | QIAGEN | 19101 | |
| RNase Free Water | IDT | – | tracrRNA Accessory Reagents |
| Serrefine clamp | Natsume Seisakusho | C-18 | |
| Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 151-21-3 | |
| Suture needle with thread | Natsume Seisakusho | C11-60B2 | |
| Thin wall borosilicate glass without filament |
Sutter Instrument | B100-75-10 | for microinjection needle and holding pipette |
| tracrRNA | IDT | – |
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