覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

すべての実験は、東京大学大学院医学系研究科・医学部動物倫理委員会および遺伝子組換え実験安全委員会の承認を受け、ガイドラインに従って実施されました。 1. 事前準備 オートクレーブまたは70%エタノールを使用して、手術に必要なすべての器具と装置を滅菌します。 ガラスピペットの準備。75 μLの校正済みキャピラリーをマイクロピペットプーラーのホルダーにしっかりと固定します。P(圧力)= 500、HEAT = 680、PULL = 30、VEL = 60、TIME = 180の推奨パラメータを使用して、プーラーをプログラムに設定します。 プログラム終了後(通常4.5〜5秒)、キャピラリーは先細りのテールを持つ2つのガラスピペットに分割されます。次に、尾の遠位部分をピンセットで破り、先端の直径を30〜50μm以内に保ちます。このためには、斜め部分の端から1 cm離れた尾を折ってください。 開頭術の場合は、UV光硬化試薬を使用して、直径4 mm、厚さ0.15 ± 0.02 mmの大きな外側のガラスディスクを、直径2 mm、厚さ0.525 ± 0.075 mmの小さな内側のガラスディスクに接着することにより、頭蓋窓を準備します(図2A)。 2.AAVインジェクション 注入装置の準備26 Gハミルトンシリンジに接続されたガラスピペットをチューブを介して定位固定装置のピペットホルダーに置き、ピペットホルダーを垂直軸から前方に60°傾けます(図1A、B)。 ガラスピペット、シリンジ、および接続チューブに流動パラフィンを入れます。シリンジをマイクロインジェクターに置きます。 手術注:以下の手術は滅菌ブースで行われました。必要に応じて実体顕微鏡を手術に使用した。7〜8週齢(体重22〜26 g)の雄性CX3CR1-EGFPマウス( 材料表の詳細情報)を気密チャンバー内で3%イソフルランで麻酔します。3分後、呼吸以外の随意運動を失ったときにマウスをチャンバーから取り出し、2%イソフルランを含む鼻管による連続麻酔に切り替えます。注:イソフルランはミクログリアを活性化することが知られています。しかし、画像化は手術の4週間後に行われるため、画像化中のマウスに対するイソフルランの影響はありません。画像化前にマウスを脳定位固定装置に入れると、イソフルラン麻酔が数分間使用されますが(ステップ4.2.1)、この短い麻酔の効果はごくわずかであることがわかりました。 手術中は、低体温を防ぐために、37°Cの加熱パッドでマウスを暖かく保ちます。角膜の乾燥を防ぐために両眼に眼軟膏を塗布し、メロキシカム注射を皮下投与します(5 mg / kg)。マウスを補助イヤーバーに取り付けてから、マウスを背側を上にして脳定位固定装置に固定します。 呼吸と心拍数を監視しながら、手術中にイソフルラン濃度を適切な割合(1%〜2%)に調整します。脱毛クリームを使用して髪を取り除き、ヨウ素ベースまたはクロルヘキシジンベースのスクラブとアルコールの両方で円を描くように頭を数回消毒します。その後、0.1mLの1%リドカインを皮下注射し、滅菌ドレープを塗布して手術部位を固定します。 ハサミで正中線に沿って頭皮を切開し、切開部を約2 cmの長さにして、右一次視覚野の上の頭蓋骨の露出を確保します。頭皮を切開した後、露出した頭蓋骨と脳が乾燥するのを防ぐために、手順全体を通して生理食塩水で頭を洗浄します。 鉗子を使用して露出した頭蓋骨の骨膜を取り除きます。脳定位固定装置座標(正中線の横3 mm、ラムダ線の前方0.5 mm)に頭蓋骨をドリルで開けて、直径約0.5 mmの小さな穴を作ります。必要に応じて、ドリルビットから血液や組織の破片を洗い流します。 以下の手順で、8.3 x 1012 ベクターゲノム/mL22の力価で1 μLのrAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07をガラスピペットに充填します。シリンジを進めて、ガラスピペットから1 μLの流動パラフィンを排出します。マウスの露出した頭蓋骨に約2 cm x 2 cmの透明なフィルムを置き、ピペッターを使用してフィルム上に1 μLのAAV溶液の液滴を排出します。 ガラスピペットチップをフィルム上のAAV溶液の液滴に入れ、シリンジをそっと引いてAAV溶液を吸引します。排出後、T字型活栓を回して、チューブとガラスピペット内の圧力を解放します。 ステップ2.2.5で作成した穴を通して脳表面から500μmの深さまでガラスピペットを挿入し、マイクロインジェクターを使用して0.5μLのAAV溶液を注入します(図1C)。注入体積流量は2.0 μL/hです。0.5μLの注射には15分かかり、その後5分間待ちます。 注射後、ガラスピペットを静かに引き出し、生理食塩水で脳表面を洗い流します。 3.頭蓋窓の移植 注:頭蓋窓の移植は、同じ日のAAV注射に続きます。 頭蓋骨に直径2.5 mmの円をマークし、ラムダから横方向に3 mmの中央に配置します。穴を開けて頭蓋骨のマークに沿って円形の溝を作成します。頭蓋骨の視界に悪影響を与える可能性があるため、破片を清掃し、穴あけプロセス中に生理食塩水を塗布して、加熱を防ぎます。 円形の溝の穴あけ深さが中央の頭蓋骨の破片を取り除くのに十分かどうかを確認するには、中央の頭蓋骨を鉗子でそっと押します。抵抗の少ない垂直方向に移動する場合は、穴あけ深さで十分です。 溝が十分な深さに達したら、鉗子の先端を中央の頭蓋骨断片の底に挿入し、ゆっくりと持ち上げて取り外して脳表面を露出させます(図1D)。 27 Gの針を使用して、露出した脳表面の端にある硬膜を刺して引き裂きます。鉗子の先端を硬膜の端に作られた穴に挿入します。硬膜を持って剥がすと、脳表面が露出します。注意: 出血が発生した場合は、出血が止まるまで生理食塩水で脳表面を洗い流してください。 鉗子を使用して、3.5 mmディッシュの生理食塩水に止血繊維を1つずつ分散させ、次に、切断された硬膜が存在する穴の縁に沿って止血繊維を配置します。 ステップ1.3で用意した頭蓋窓を露出した脳表面に置き、窓が頭蓋骨に密着するように窓を軽く押しながら瞬間接着剤で頭蓋骨に接着します。 その後、露出した頭蓋骨全体に瞬間接着剤を塗布し、ヘッドプレートを頭蓋骨に慎重に取り付けて、窓がヘッドプレートの四角い穴の中心に位置するようにします(図2C)。ヘッドプレートの表面がガラス窓の表面と平行であることを確認します。 接着剤が十分に硬化したら、露出した頭蓋骨に歯科用セメントを塗布して、ヘッドとヘッドプレートの間の取り付けを強化します(図2)。注:実験にマウスへの視覚刺激の提示が含まれる場合は、イメージング領域への迷光を避ける必要があります。光反射を減らすために、セメントを活性炭と混合して黒くすることをお勧めします。 セメントが十分に硬化した後(約20分)、マウスを麻酔から引き離します。次に、マウスを新しいケージに入れて、単独で回復します。 意識と自発的な動きを確認し、完全に回復したことを確認した後、マウスをホームケージに戻します。回復中に、明らかな痛みを示す行動が発生した場合は、2回目または必要に応じてメロキシカム用量(24時間に1回、1〜3日間)を投与します。. 4. ミクログリアと神経細胞カルシウム動態の in vivo 二光子イメージング 顕微鏡装置へのマウスの馴化手術の3週間後、3%イソフルランでマウスに麻酔を誘発し、カスタムメイドの定位固定装置を使用して2光子顕微鏡の25倍対物レンズの下にマウスをセットしました(図3C)。ここでのセットアップでは、マウスをトレッドミルの上に置き、自由に走らせます。 約10分後、マウスを顕微鏡ステージから取り外し、ホームケージに戻します。2光子画像を取得する前に、隔日で少なくとも3回慣れを繰り返します。 2光子画像取得注:ミクログリアの活性化は徐々に基礎レベルに戻るため、術後4週間以上で画像取得を行うことをお勧めします。ステップ4.1と同様に、3%イソフルランでマウスに麻酔を誘発し、カスタムメイドの定位固定装置を使用してマウスを2光子顕微鏡の対物レンズの下にセットします。 以下に説明するように、カスタムメイドのシェーディングデバイスと視覚刺激用のLCDモニターを取り付けます(図3D)。レンズを脳表面に焦点を合わせるように配置し、このレンズ位置を元のZ位置として設定します。x-y座標を一定に保ち、対物レンズを持ち上げます。マウスと定位固定装置を対物レンズとトレッドミルから取り外します。 木炭粉末と混合して黒くなるシリコーンを使用してヘッドプレートの上部に遮光装置を取り付け、ヘッドプレートと遮光装置の間のスペースが十分に密閉されていることを確認します。 シェーディングデバイスを蒸留水で満たしてから、マウスと定位固定装置フレームを対物レンズの下とトレッドミルに再度固定します。脳表面の焦点面を慎重にリセットし、対物レンズの深さを確認します。注意: 対物レンズを損傷するリスクを回避するために、最初にxyz座標を設定してから、対物レンズのシェーディングデバイスを適用します。最初にカバーを取り付けてから座標を調整することも合理的ですが、このオプションには慎重な取り扱いが必要です。 対物レンズを介した視覚刺激に使用されるLCDモニターからの光の汚染を避けるために、対物レンズを黒いアルミホイルで覆います(図3D)。10インチのLCDモニターをマウスの目の前12.5 cmに設定して、視覚刺激を表示します(図3D)。 蛍光発光収集フィルターをEGFP蛍光(525/50 nm発光フィルター)とR-CaMP蛍光(593/46 nm発光フィルター)に設定し、励起波長を1,000 nmに設定します。25x 1.1 NA対物レンズとGaAsP PMTを使用して、0.25 μm/ピクセルの空間分解能で画像を取得します。 R-CaMP(+)ニューロンとEGFP(+)ミクログリアが2/3層で同時にイメージングできるイメージング領域を見つけます。この設定では、 図4 と ビデオ1 で得られたデータは、ライブ画像プレビューを使用して、パイアル表面から100μmの深さにありました。励起レーザーの出力をできるだけ低くして、イメージング領域の局所温度の上昇によって引き起こされる光退色や損傷を回避します。 画像取得と同時に、100%コントラスト、1.5Hz、1度あたり0.04サイクルで、0°から150°までの6つの方向で30°ステップで1度あたり0.04サイクルのドリフトグレーティング視覚刺激をマウス17に提示します。 画像取得後、マウスを顕微鏡ステージから取り外し、シェーディングデバイスと定位固定装置をマウスから取り外し、マウスをホームケージに戻します。 データ登録取得した画像データ(この場合はnd2形式)を、フィジーまたは顕微鏡に付属のソフトウェアを使用して、カラーチャンネルごとに一連のtiff画像ファイルとして変換して保存します。 フィジーのプラグインであるTurboregを適用して、モード=翻訳で登録を実行します。平均画像をEGFPチャンネルのtiff画像ファイルで参照画像として使用します。 MATLABを使用してフレームごとに以下の処理を行います。注:以下の処理ではMATLABを使用しますが、Pythonなどの他のプログラミングソフトウェアでデータを分析できるように、主に各ステップの意図に焦点を当てています。imread機能を使用すると、同じフレームの登録前と登録後にそれぞれ2つのEGFPtiff画像を読み込みます。imread 関数を使用して、同じフレームの R-CaMP tiff 画像を読み込みます。 normcorr2 関数を使用して、ステップ 4.3.3.1 で読み取られた 2 つの GFP 画像のベクトル化された変数間の相関関数を計算します。 max関数を使用して相関関数の相互相関が最も高い線形インデックスを検出し、ind2sub関数を使用して、元の画像から登録画像の移動位置を計算します。 インワープ関数を使用して、R-CaMP画像を手順4.3.3.3で計算した位置に変換し、次にインライト機能を使用してR-CaMPの登録画像を保存します。 微量カルシウムの生成MATLABを用いて以下の処理を行います。imread 関数を使用して、ステップ 4.3.3.4 で生成されたすべての登録済み R-CaMP tiff イメージを読み込みます。登録済みの画像が既にワークスペースに変数として読み込まれている場合は、この手順を省略します。 平均関数を使用して、時間投影画像を生成します。imshow 関数を使用して、平均化された画像を図として表示します。roipoly関数を使用して、ターゲット構造(このデータでは樹状突起スパイン)のバイナリROIマスクを生成します。 バイナリマスクに各フレームの画像を入力変数として乗算した画像の平均関数を使用して、各フレームのROI内の平均蛍光強度を計算します。 前述の17のように、ステップ4.4.3で得られた変数に、高周波ノイズをカットするためにカットオフ=1.6秒でバターワース周波数フィルタを適用し、次にタイムウィンドウ=200秒でスライディングメディアンフィルタを適用して低周波ノイズをカットする。