Imagerie simultanée de la dynamique microgliale et de l’activité neuronale chez des souris éveillées

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité d’éthique animale et le Comité de sécurité des expériences génétiques recombinantes de l’École supérieure de médecine et de la Faculté de médecine de l’Université de Tokyo, et réalisées conformément à leurs directives. 1. Préparation Stériliser tous les instruments et appareils nécessaires à la chirurgie à l’aide d’autoclave ou d’éthanol à 70%. Préparation de pipettes en verre.Fixez fermement un capillaire calibré de 75 μL au support de l’extracteur de micropipettes. Réglez l’extracteur sur le programme avec les paramètres recommandés comme P (pression) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180. Après avoir terminé le programme (généralement 4,5 à 5 s), le capillaire est divisé en deux pipettes en verre avec des queues effilées. Ensuite, cassez la partie distale de la queue avec une pince à épiler pour maintenir le diamètre de la pointe à 30-50 μm. Pour cela, cassez les queues de 1 cm distale jusqu’à l’extrémité de la partie biseautée. Pour la craniotomie, préparer une fenêtre crânienne en collant un disque de verre extérieur plus grand, de 4 mm de diamètre, 0,15 ± 0,02 mm d’épaisseur, sur un disque de verre intérieur plus petit, de 2 mm de diamètre et de 0,525 ± 0,075 mm d’épaisseur, à l’aide d’un réactif de durcissement à la lumière UV (figure 2A). 2. Injection d’AAV Préparation de l’appareil d’injectionPlacer une pipette en verre reliée à une seringue Hamilton de 26 G à travers un tube sur un porte-pipette d’un instrument stéréotaxique, puis incliner le porte-pipette de 60° vers l’avant par rapport à l’axe vertical (figure 1A,B). Remplissez la pipette en verre, la seringue et le tube de raccordement avec de la paraffine liquide. Placez la seringue sur un micro-injecteur. Intervention chirurgicaleNOTE: La chirurgie suivante a été effectuée dans une cabine stérilisée. Un stéréomicroscope a été utilisé pour la chirurgie si nécessaire.Anesthésier une souris CX3CR1-EGFP mâle (informations détaillées dans le tableau des matériaux) à l’âge de 7 à 8 semaines (poids corporel 22-26 g) avec 3% d’isoflurane dans une chambre étanche aux gaz. Après 3 min, sortez la souris de la chambre lorsqu’elle perd son mouvement volontaire sauf la respiration, puis passez à une anesthésie continue par un tube nasal contenant 2% d’isoflurane.REMARQUE: L’isoflurane est connu pour activer la microglie. Cependant, comme l’imagerie est effectuée 4 semaines après la chirurgie, il n’y a aucun effet de l’isoflurane sur les souris pendant l’imagerie. Bien que l’anesthésie à l’isoflurane soit utilisée pendant quelques minutes lorsque les souris sont placées dans l’instrument stéréotaxique avant l’imagerie (étape 4.2.1), nous avons constaté que l’effet de cette anesthésie courte est négligeable. Pendant la chirurgie, gardez la souris au chaud avec un coussin chauffant à 37 °C pour prévenir l’hypothermie. Appliquer une pommade oculaire sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse cornéenne et administrer une injection de méloxicam, par voie sous-cutanée (5 mg / kg). Fixez la souris à une barre d’oreille auxiliaire, puis fixez la souris sur l’instrument stéréotaxique avec son côté dorsal vers le haut. Ajustez la concentration d’isoflurane à un pourcentage approprié (1%-2%) pendant la chirurgie tout en surveillant la respiration et la fréquence cardiaque. Enlevez les cheveux à l’aide d’une crème dépilatoire et désinfectez la tête plusieurs fois dans un mouvement circulaire avec un gommage à base d’iode ou de chlorhexidine et de l’alcool. Ensuite, injectez 0,1 mL de lidocaïne à 1% par voie sous-cutanée et appliquez des champs stériles pour sécuriser le site chirurgical. Inciser le cuir chevelu ouvert le long de la ligne médiane avec des ciseaux et faire l’incision d’environ 2 cm de long, pour assurer une bonne exposition du crâne au-dessus du cortex visuel primaire droit. Après l’incision du cuir chevelu, irriguez la tête avec une solution saline tout au long de la procédure pour empêcher le crâne et le cerveau exposés de sécher. Retirez le périoste sur le crâne exposé à l’aide d’une pince. Percez le crâne sur les coordonnées stéréotaxiques : 3 mm latéralement à la ligne médiane, 0,5 mm en avant de la ligne lambda, pour créer un petit trou d’environ 0,5 mm de diamètre. Rincez le sang et les débris tissulaires du foret, si nécessaire. Remplir la pipette en verre avec 1 μL de rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 en utilisant la procédure suivante à un titre de 8,3 x 1012 génomes vectoriels/mL22.Avancer la seringue pour éjecter 1 μL de paraffine liquide de la pipette en verre. Placez un morceau de film transparent, d’environ 2 cm x 2 cm, sur le crâne exposé de la souris et expulsez une gouttelette de 1 μL de solution AAV sur le film à l’aide d’un pipeteur. Placez l’embout de la pipette en verre dans la gouttelette de solution AAV sur le film et tirez doucement la seringue pour aspirer la solution AAV. Après l’éjection, tournez le robinet d’arrêt en forme de T pour relâcher la pression à l’intérieur du tube et de la pipette en verre. Insérez la pipette en verre à une profondeur de 500 μm de la surface du cerveau à travers le trou créé à l’étape 2.2.5, puis injectez 0,5 μL de solution AAV à l’aide du micro-injecteur (Figure 1C). Utiliser le débit volumique d’injection de 2,0 μL/h; une injection de 0,5 μL prend 15 min, puis attend 5 min. Après l’injection, retirez doucement la pipette en verre et rincez la surface du cerveau avec une solution saline. 3. Implantation de fenêtre crânienne REMARQUE: L’implantation de la fenêtre crânienne suit l’injection d’AAV le même jour. Marquez un cercle de 2,5 mm de diamètre sur le crâne, centré latéralement à 3 mm du lambda. Créez une rainure circulaire le long de la marque sur le crâne en perçant. Nettoyez les débris car cela pourrait nuire à la visibilité du crâne et appliquez une solution saline pendant le processus de forage pour éviter le chauffage. Pour vérifier si la profondeur de perçage dans la rainure circulaire est suffisante pour enlever le fragment de crâne central, appuyez doucement sur le crâne central avec une pince. S’il se déplace verticalement avec peu de résistance, la profondeur de forage est suffisante. Lorsque la rainure atteint une profondeur suffisante, insérez l’extrémité de la pince dans le bas du fragment de crâne central et soulevez-la doucement et retirez-la pour exposer la surface du cerveau (Figure 1D). À l’aide d’une aiguille de 27 G, piquer et déchirer la dure-mère au bord de la surface exposée du cerveau. Insérez la pointe de la pince à travers le trou fait au bord de la dure-mère. Tenez la dure-mère et décollez-la pour exposer la surface du cerveau.REMARQUE: En cas de saignement, rincer la surface du cerveau avec une solution saline jusqu’à ce que le saignement cesse. À l’aide d’une pince, dispersez les fibres hémostatiques une par une dans une solution saline dans une boîte de 3,5 mm, puis placez les fibres hémostatiques le long des marges du trou dans lequel la dure-mère transectée est présente. Placez une fenêtre crânienne préparée à l’étape 1.3 sur la surface exposée du cerveau, puis collez-la au crâne avec de la colle instantanée tout en appuyant doucement sur la fenêtre afin que la fenêtre soit en contact étroit avec le crâne. Ensuite, appliquez de la colle instantanée sur tout le crâne exposé, puis fixez soigneusement une plaque de tête sur le crâne de sorte que la fenêtre se situe au centre du trou carré de la plaque de tête (Figure 2C). Assurez-vous que la surface de la plaque de tête est parallèle à la surface de la fenêtre en verre. Une fois que la colle a suffisamment durci, appliquez du ciment dentaire sur le crâne exposé pour renforcer la fixation entre la tête et la plaque de tête (Figure 2).REMARQUE: Si les expériences comprennent la présentation de stimuli visuels à des souris, la lumière parasite vers la zone d’imagerie doit être évitée. Il est conseillé de noircir le ciment en le mélangeant avec le charbon actif pour la réduction de la réflexion de la lumière. Retirez la souris de l’anesthésie après que le ciment a suffisamment durci (environ 20 min). Ensuite, mettez la souris dans une nouvelle cage pour récupérer seule. Après avoir confirmé sa conscience et son mouvement volontaire, indiquant un rétablissement complet, remettez la souris dans la cage familiale. Pendant la récupération, administrer une deuxième dose, ou plus si nécessaire, de méloxicam (une fois toutes les 24 heures pendant 1 à 3 jours) si des comportements évidents indiquant la douleur se produisent. 4. Imagerie in vivo à deux photons de la microglie et de la dynamique calcique neuronale Habituation des souris à l’appareil de microscopeTrois semaines après la chirurgie, induisez une anesthésie chez la souris avec 3% d’isoflurane et placez la souris sous la lentille de l’objectif 25x d’un microscope à deux photons à l’aide d’un instrument stéréotaxique sur mesure (Figure 3C). Pour la configuration ici, la souris est placée sur le dessus d’un tapis roulant et autorisée à fonctionner librement. Environ 10 minutes plus tard, retirez la souris de l’étape du microscope et ramenez-la dans la cage de la maison. Répétez l’accoutumance au moins 3 fois tous les deux jours avant l’acquisition d’images à deux photons. Acquisition d’images à deux photonsREMARQUE: Nous recommandons d’effectuer l’acquisition d’image plus de 4 semaines après la chirurgie, car l’activation microgliale revient progressivement au niveau basal.Comme à l’étape 4.1, induire une anesthésie chez la souris avec 3% d’isoflurane et placer la souris sous la lentille objective du microscope à deux photons à l’aide d’un instrument stéréotaxique sur mesure. Installez le dispositif d’ombrage sur mesure et un moniteur LCD pour la stimulation visuelle comme décrit ci-dessous (Figure 3D).Positionnez la lentille pour qu’elle fasse la mise au point sur la surface du cerveau, puis définissez cette position de lentille sur la position Z d’origine. Gardez les coordonnées x-y constantes et élevez l’objectif de l’objectif; Retirez la souris et l’instrument stéréotaxique de l’objectif et du tapis roulant. Fixez un dispositif d’ombrage sur le dessus de la plaque de tête en utilisant du silicone, qui est noirci en mélangeant avec de la poudre de charbon de bois, et assurez-vous que l’espace entre la plaque de tête et le dispositif d’ombrage est bien scellé. Remplissez le dispositif d’ombrage avec de l’eau distillée, puis fixez à nouveau la souris et le cadre stéréotaxique sous l’objectif et sur le tapis roulant. Réinitialisez soigneusement le plan focal à la surface du cerveau, en vérifiant la profondeur de la lentille de l’objectif.REMARQUE: Pour éviter le risque d’endommager l’objectif de l’objectif, définissez d’abord les coordonnées xyz, puis appliquez le dispositif d’ombrage de l’objectif d’objectif. Il est également raisonnable d’installer d’abord le couvercle, puis d’ajuster les coordonnées, mais une manipulation prudente est nécessaire pour cette option. Recouvrez la lentille de l’objectif avec une feuille d’aluminium noire pour éviter la contamination lumineuse du moniteur LCD utilisé pour la stimulation visuelle à travers la lentille de l’objectif (Figure 3D). Réglez un moniteur LCD de 10 pouces à 12,5 cm devant les yeux de la souris pour présenter des stimuli visuels (Figure 3D). Configurez les filtres de collecte des émissions de fluorescence sur la fluorescence EGFP (filtre d’émission 525/50 nm) et la fluorescence R-CaMP (filtre d’émission 593/46 nm) et la longueur d’onde d’excitation sur 1 000 nm. Acquérir des images avec une résolution spatiale de 0,25 μm/pixel à l’aide d’un objectif 25x 1,1 NA et de PMT GaAsP. Trouvez la région d’imagerie dans laquelle les neurones R-CaMP(+) et la microglie EGFP(+) peuvent être imagés simultanément dans la couche 2/3. Pour cette configuration, les données obtenues dans la figure 4 et la vidéo 1 étaient à une profondeur de 100 μm de la surface piale, en utilisant un aperçu d’image en direct. Maintenez la puissance du laser d’excitation aussi faible que possible pour éviter le photoblanchiment et les dommages causés par l’augmentation de la température locale dans la région d’imagerie. Acquérir des images à la fréquence d’images de 30 Hz. Simultanément à l’acquisition d’image, présenter un stimulus visuel à dérive-réseau à 100% de contraste, 1,5 Hz, 0,04 cycles par degré dans 12 directions à 6 orientations de 0° à 150° par pas de 30° à la souris17. Après l’acquisition de l’image, retirez la souris de l’étage du microscope, détachez le dispositif d’ombrage et l’instrument stéréotaxique de la souris et remettez la souris dans sa cage d’origine. Enregistrement des donnéesConvertissez et enregistrez les données d’image acquises (format nd2 dans ce cas) sous forme de fichiers d’image tiff pour chaque canal de couleur, en utilisant Fiji ou le logiciel fourni avec le microscope. Appliquez Turboreg, un plugin des Fidji, pour effectuer l’enregistrement avec mode = traduction. Utilisez l’image moyennée comme image de référence avec les fichiers image tiff du canal EGFP. Effectuez le traitement suivant pour chaque image à l’aide de MATLAB.REMARQUE: Bien que MATLAB soit utilisé dans le traitement suivant, la description se concentre principalement sur l’intention de chaque étape afin que les données puissent être analysées par d’autres logiciels de programmation tels que Python.Utilisez la fonction imread pour lire deux images tiff EGFP avant et après l’enregistrement de la même image, respectivement. Utilisez la fonction imread pour lire l’image tiff R-CaMP de la même image. Utilisez la fonction normcorr2 pour calculer la fonction de corrélation entre les variables vectorisées des deux images GFP lues à l’étape 4.3.3.1. Utilisez la fonction max pour détecter l’index linéaire avec la corrélation croisée la plus élevée de la fonction de corrélation, puis utilisez la fonction ind2sub pour calculer la position de mouvement de l’image enregistrée à partir de son image d’origine. Utilisez la fonction imwarp pour traduire l’image R-CaMP à la position calculée à l’étape 4.3.3.3, puis utilisez la fonction imwrite pour enregistrer l’image enregistrée de R-CaMP. Génération de traces de calciumEffectuez le traitement suivant à l’aide de MATLAB. Utilisez la fonction imread pour lire toutes les images tiff R-CaMP enregistrées générées à l’étape 4.3.3.4. Si les images enregistrées ont déjà été chargées en tant que variable dans l’espace de travail, omettez cette étape. Utilisez la fonction moyenne pour générer une image de projection temporelle. Utilisez la fonction imshow pour afficher l’image moyennée sous forme de figure; utiliser la fonction roipoly pour générer un masque ROI binaire de la structure cible (colonne vertébrale dendritique dans ces données). En utilisant la fonction moyenne avec les images obtenues en multipliant le masque binaire par des images de chaque image comme variables d’entrée, calculez l’intensité de fluorescence moyenne dans le ROI pour chaque image. Comme décrit précédemment17, à la variable obtenue à l’étape 4.4.3, appliquer le filtre de fréquence de valeur du beurre à la coupure = 1,6 s, pour couper le bruit à haute fréquence, puis appliquer le filtre médian coulissant à la fenêtre de temps = 200 s, pour couper le bruit à basse fréquence.