Imagem Simultânea da Dinâmica Microglial e Atividade Neuronal em Camundongos Acordados

Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal e pelo Comitê de Segurança de Experimentos Recombinantes Genéticos da Escola de Pós-Graduação em Medicina e Faculdade de Medicina da Universidade de Tóquio e realizados de acordo com suas diretrizes. 1. Preparo Esterilizar todos os instrumentais e equipamentos necessários para a cirurgia em autoclave ou etanol 70%. Preparação de pipeta de vidro.Fixe firmemente um capilar calibrado de 75 μL no suporte do puxador de micropipetas. Ajuste o extrator para o programa com os parâmetros recomendados como P (pressão) = 500, CALOR = 680, TRAÇÃO = 30, VEL = 60, TEMPO = 180. Após o término do programa (geralmente 4,5 a 5 s), o capilar é dividido em duas pipetas de vidro com caudas afiladas. Em seguida, quebre a parte distal da cauda com uma pinça para manter o diâmetro da ponta dentro de 30-50 μm. Para isso, quebre as caudas 1 cm distal ao final da parte chanfrada. Para craniotomia, preparar uma janela craniana colando um disco de vidro externo maior, de 4 mm de diâmetro, 0,15 ± 0,02 mm de espessura, em um disco de vidro interno menor, de 2 mm de diâmetro, 0,525 ± 0,075 mm de espessura, usando um reagente fotopolimerizável UV (Figura 2A). 2. Injeção de AAV Preparação do aparelho de injecçãoColoque uma pipeta de vidro conectada a uma seringa Hamilton 26 G através de um tubo sobre um suporte de pipeta de um instrumento estereotáxico e, em seguida, incline o suporte de pipeta 60° anteriormente a partir do eixo vertical (Figura 1A,B). Encha a pipeta de vidro, a seringa e o tubo de ligação com parafina líquida. Coloque a seringa em um microinjetor. Procedimento cirúrgicoOBS: A seguinte cirurgia foi realizada em cabina esterilizada. Um estereomicroscópio foi usado para a cirurgia, se necessário.Anestesiar um camundongo CX3CR1-EGFP macho (informações detalhadas na Tabela de Materiais) com 7 a 8 semanas de idade (peso corporal 22-26 g) com isoflurano a 3% em uma câmara estanque ao gás. Após 3 min, retirar o camundongo da câmara quando ele perder o movimento voluntário, exceto a respiração, e então mudar para anestesia contínua por um tubo nasal com isoflurano a 2%.NOTA: O isoflurano é conhecido por ativar a micróglia. No entanto, como os exames de imagem são realizados 4 semanas após a cirurgia, não há efeito do isoflurano nos camundongos durante os exames de imagem. Embora a anestesia com isoflurano seja usada por alguns minutos quando camundongos são colocados no instrumento estereotáxico antes da aquisição de imagens (passo 4.2.1), descobrimos que o efeito dessa anestesia curta é desprezível. Durante a cirurgia, mantenha o rato aquecido com uma almofada de aquecimento a 37 °C para evitar a hipotermia. Aplicar pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento da córnea e administrar uma injeção de meloxicam, por via subcutânea (5 mg/kg). Conecte o mouse a uma barra de ouvido auxiliar e, em seguida, fixe o mouse no instrumento estereotáxico com seu lado dorsal para cima. Ajustar a concentração de isoflurano para uma porcentagem adequada (1%-2%) durante a cirurgia enquanto monitora a respiração e a frequência cardíaca. Retire os pelos usando creme depilatório e desinfete a cabeça várias vezes em movimento circular com um esfoliante à base de iodo ou clorexidina e álcool. Em seguida, injetar 0,1 mL de lidocaína a 1% por via subcutânea e aplicar campos estéreis para fixar o sítio cirúrgico. Incise o couro cabeludo aberto ao longo da linha média com tesoura e faça a incisão com cerca de 2 cm de comprimento, para garantir uma boa exposição do crânio acima do córtex visual primário direito. Após a incisão do couro cabeludo, irrige a cabeça com soro fisiológico durante todo o procedimento para evitar que o crânio e o cérebro expostos sequem. Remova o periósteo do crânio exposto com pinças. Perfurar o crânio nas coordenadas estereotáxicas: 3 mm lateral à linha média, 0,5 mm anterior à linha lambda, para criar um pequeno orifício com aproximadamente 0,5 mm de diâmetro. Enxágue o sangue e os restos de tecido da broca, se necessário. Encher a pipeta de vidro com 1 μL de rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 utilizando o seguinte procedimento a um título de 8,3 x10 12 genomas vectoriais/ml22.Avançar a seringa para ejetar 1 μL de parafina líquida da pipeta de vidro. Coloque um pedaço de filme transparente, aproximadamente 2 cm x 2cm, sobre o crânio exposto do rato e expulse uma gota de 1 μL de solução de AAV sobre o filme utilizando um pipetador. Coloque a ponta da pipeta de vidro na gota da solução de AAV sobre o filme e puxe suavemente a seringa para aspirar a solução de AAV. Após a ejeção, gire a torneira em forma de T para liberar a pressão dentro do tubo e da pipeta de vidro. Introduzir a pipeta de vidro a uma profundidade de 500 μm a partir da superfície cerebral através do orifício criado no passo 2.2.5 e, em seguida, injectar 0,5 μL de solução de AAV utilizando o microinjector (Figura 1C). Utilizar o fluxo volumétrico de injeção de 2,0 μL/h; uma injeção de 0,5 μL leva 15 minutos e, em seguida, espera 5 min. Após a injeção, retire suavemente a pipeta de vidro e lave a superfície cerebral com soro fisiológico. 3. Implante de janela craniana NOTA: O implante de janela craniana segue a injeção de AAV no mesmo dia. Marcar um círculo de 2,5 mm de diâmetro no crânio, centrado 3 mm lateralmente da lambda. Crie um sulco circular ao longo da marca no crânio perfurando. Limpe os detritos, pois pode afetar negativamente a visibilidade do crânio e aplique soro fisiológico durante o processo de perfuração para evitar o aquecimento. Para verificar se a profundidade de perfuração no sulco circular é suficiente para remover o fragmento central do crânio, pressione suavemente o crânio central com pinças. Se ele se move verticalmente com pouca resistência, a profundidade de perfuração é suficiente. Quando o sulco atingir profundidade suficiente, insira a ponta da pinça na parte inferior do fragmento central do crânio e levante-o e remova-o suavemente para expor a superfície cerebral (Figura 1D). Usando uma agulha de 27 G, pice e rasgue a dura-máter na borda da superfície cerebral exposta. Insira a ponta da pinça através do orifício feito na borda da dura-máter. Segure a dura-máter e descasque-a para expor a superfície cerebral.NOTA: Se ocorrer sangramento, lave a superfície do cérebro com soro fisiológico até que o sangramento pare. Com o uso de pinças, dispersar as fibras hemostáticas, uma a uma, em solução salina, em uma placa de 3,5 mm e, em seguida, colocar as fibras hemostáticas ao longo das margens do orifício em que a dura-máter transeccionada está presente. Coloque uma janela craniana preparada no passo 1.3 na superfície exposta do cérebro e, em seguida, cole-a ao crânio com cola instantânea enquanto pressiona suavemente a janela para que a janela fique em contato próximo com o crânio. Em seguida, aplique cola instantânea em todo o crânio exposto e, em seguida, fixe cuidadosamente uma placa de cabeça no crânio para que a janela se localize no centro do orifício quadrado da placa da cabeça (Figura 2C). Certifique-se de que a superfície da placa principal esteja paralela à superfície da janela de vidro. Após a cola endurecer o suficiente, aplicar cimento dentário no crânio exposto para reforçar a fixação entre a cabeça e a placa-cabeça (Figura 2).NOTA: Se os experimentos incluírem a apresentação de estímulos visuais para camundongos, a luz perdida para a área de imagem deve ser evitada. É aconselhável escurecer o cimento misturando-o com o carvão ativado para a redução da reflexão da luz. Retire o rato da anestesia depois de o cimento ter endurecido suficientemente (cerca de 20 min). Em seguida, coloque o rato em uma nova gaiola para se recuperar sozinho. Depois de confirmar sua consciência e movimento voluntário, indicando recuperação completa, coloque o camundongo de volta na gaiola de casa. Durante a recuperação, administrar uma segunda dose, ou mais, se necessário, de meloxicam (uma vez a cada 24 horas durante 1-3 dias) se ocorrerem comportamentos indicativos de dor óbvios. 4. Imagem in vivo de dois fótons da microglia e dinâmica neuronal do cálcio Habituação de camundongos ao aparelho microscópicoTrês semanas após a cirurgia, induzir anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e colocá-lo sob a lente objetiva de 25x de um microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico feito sob medida (Figura 3C). Para a configuração aqui, o mouse é colocado na parte superior de uma esteira e permitido correr livremente. Aproximadamente 10 minutos depois, remova o camundongo do estágio do microscópio e devolva-o à gaiola doméstica. Repetir a habituação pelo menos 3 vezes a cada dia alternado antes da aquisição da imagem de dois fótons. Aquisição de imagens de dois fótonsOBS: Recomendamos realizar a aquisição das imagens mais de 4 semanas após a cirurgia, pois a ativação microglial retorna gradualmente ao nível basal.Como no passo 4.1, induzir anestesia no camundongo com isoflurano a 3% e colocá-lo sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons usando um instrumento estereotáxico personalizado. Instale o dispositivo de sombreamento personalizado e um monitor LCD para estimulação visual, conforme descrito abaixo (Figura 3D).Posicione a lente para focar na superfície do cérebro e, em seguida, defina essa posição da lente como a posição Z original. Mantenha as coordenadas x-y constantes e eleve a lente objetiva; Remova o mouse e o instrumento estereotáxico da lente objetiva e da esteira. Fixe um dispositivo de sombreamento na parte superior da placa da cabeça usando silicone, que é escurecido pela mistura com pó de carvão, e certifique-se de que o espaço entre a placa da cabeça e o dispositivo de sombreamento esteja bem vedado. Encha o dispositivo de sombreamento com água destilada e, em seguida, fixe o mouse e o quadro estereotáxico novamente sob a objetiva e na esteira. Redefina cuidadosamente o plano focal na superfície do cérebro, verificando a profundidade da lente objetiva.NOTA: Para evitar o risco de danificar a lente objetiva, defina as coordenadas xyz primeiro e, em seguida, aplique o dispositivo de sombreamento da lente objetiva. Também é razoável instalar a tampa primeiro e, em seguida, ajustar as coordenadas, mas o manuseio cauteloso é necessário para essa opção. Cubra a lente objetiva com papel alumínio preto para evitar a contaminação luminosa do monitor LCD utilizado para estimulação visual através da lente objetiva (Figura 3D). Ajuste um monitor LCD de 10 polegadas a 12,5 cm à frente dos olhos do mouse para apresentar estímulos visuais (Figura 3D). Configure os filtros de coleta de emissão de fluorescência para fluorescência EGFP (filtro de emissão de 525/50 nm) e fluorescência R-CaMP (filtro de emissão de 593/46 nm) e o comprimento de onda de excitação para 1.000 nm. Adquira imagens com resolução espacial de 0,25 μm/pixel utilizando objetiva 25x 1,1 NA e PMTs GaAsP. Encontre a região de imagem na qual os neurônios R-CaMP(+) e a microglia EGFP(+) podem ser fotografados simultaneamente na camada 2/3. Para esta configuração, os dados obtidos na Figura 4 e no Vídeo 1 estavam a uma profundidade de 100 μm da superfície pial, usando uma visualização de imagem ao vivo. Mantenha a potência do laser de excitação o mais baixa possível para evitar o fotoclareamento e os danos causados pelo aumento da temperatura local na região da imagem. Adquira imagens na taxa de quadros de 30 Hz. Simultaneamente com a aquisição da imagem, apresente um estímulo visual de grade de deriva a 100% de contraste, 1,5 Hz, 0,04 ciclos por grau em 12 direções em 6 orientações de 0° a 150° em passos de 30° para o mouse17. Após a aquisição da imagem, remova o mouse do estágio do microscópio, retire o dispositivo de sombreamento e o instrumento estereotáxico do mouse e devolva o mouse à sua gaiola inicial. Cadastro de dadosConverta e salve os dados de imagem adquiridos (formato nd2 neste caso) como uma série de arquivos de imagem tiff para cada canal de cor, usando Fiji ou o software fornecido com o microscópio. Aplique o Turboreg, um plugin de Fiji, para realizar o registro com mode = translation. Use a imagem média como a imagem de referência com os arquivos de imagem tiff do canal EGFP. Execute o processamento a seguir para cada quadro usando o MATLAB.NOTA: Embora o MATLAB seja usado no processamento a seguir, a descrição se concentra principalmente na intenção de cada etapa para que os dados possam ser analisados por outros softwares de programação, como o Python.Use a função imread para ler duas imagens tiff EGFP antes e depois do registro do mesmo quadro, respectivamente. Use a função imread para ler a imagem tiff R-CaMP do mesmo quadro. Use a função normcorr2 para calcular a função de correlação entre as variáveis vetorizadas das duas imagens de GFP lidas na etapa 4.3.3.1. Use a função max para detectar o índice linear com a maior correlação cruzada da função de correlação e, em seguida, use a função ind2sub para calcular a posição de movimento da imagem registrada a partir de sua imagem original. Use a função imwarp para traduzir a imagem R-CaMP para a posição calculada na etapa 4.3.3.3 e, em seguida, use a função imwrite para salvar a imagem registrada do R-CaMP. Geração de traços de cálcioExecute o processamento a seguir usando o MATLAB. Use a função imread para ler todas as imagens tiff R-CaMP registradas geradas na etapa 4.3.3.4. Se as imagens registradas já tiverem sido carregadas como uma variável no espaço de trabalho, omita esta etapa. Use a função mean para gerar uma imagem de projeção de tempo. Use a função imshow para mostrar a imagem média como uma figura; use a função roipoly para gerar uma máscara de ROI binária da estrutura alvo (coluna dendrítica nesses dados). Usando a função média com as imagens obtidas multiplicando a máscara binária com imagens de cada quadro como variáveis de entrada, calcule a intensidade média de fluorescência dentro da ROI para cada quadro. Como descrito anteriormente17, para a variável obtida no passo 4.4.3, aplicar o filtro de frequência de manteiga no ponto de corte = 1,6 s, para cortar ruído de alta frequência, e em seguida aplicar o filtro de mediana deslizante na janela de tempo = 200 s, para cortar ruído de baixa frequência.