הדמיה סימולטנית של דינמיקה מיקרוגליאלית ופעילות עצבית בעכברים ערים

כל הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים והוועדה לבטיחות ניסויים רקומביננטיים גנטיים של בית הספר לרפואה והפקולטה לרפואה באוניברסיטת טוקיו, ובוצעו בהתאם להנחיותיהן. 1. הכנה לעקר את כל המכשירים והמנגנונים הדרושים לניתוח באמצעות autoclave או 70% אתנול. הכנת פיפטה זכוכית.קבע היטב נימי 75 μL מכויל למחזיק המושך micropipette. הגדר את המושך לתוכנית עם הפרמטרים המומלצים כ- P (לחץ) = 500, חום = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180. לאחר סיום התוכנית (בדרך כלל 4.5 עד 5 שניות), הנימים מחולקים לשתי פיפטות זכוכית עם זנבות מתחדדים. לאחר מכן, שברו את החלק הדיסטלי של הזנבות בפינצטה כדי לשמור על קוטר הקצה בטווח של 30-50 מיקרומטר. לשם כך, לשבור את הזנבות 1 ס”מ דיסטלי עד סוף החלק המשופע. עבור קרניוטומיה, הכינו חלון גולגולתי על-ידי הדבקת דיסק זכוכית חיצוני גדול יותר, בקוטר 4 מ”מ, בעובי 0.15 ± 0.02 מ”מ, לדיסק זכוכית פנימי קטן יותר, בקוטר 2 מ”מ, בעובי 0.525 ± 0.075 מ”מ, באמצעות מגיב ריפוי אור UV (איור 2A). 2. הזרקת AAV הכנת מנגנון הזרקההניחו פיפטה מזכוכית המחוברת למזרק המילטון 26G דרך צינור על מחזיק פיפטה של מכשיר סטריאוטקסי, ולאחר מכן הטו את מחזיק הפיפט 60° קדימה מהציר האנכי (איור 1A,B). ממלאים את פיפטת הזכוכית, המזרק וצינור החיבור בפרפין נוזלי. מניחים את המזרק על מזרק מיקרו. הליך כירורגיהערה: הניתוח הבא בוצע בתא מעוקר. לצורך הניתוח נעשה שימוש בסטריאומיקרוסקופ במידת הצורך.מרדימים עכבר CX3CR1-EGFP זכר (מידע מפורט בטבלת החומרים) בגיל 7 עד 8 שבועות (משקל גוף 22-26 גרם) עם 3% איזופלורן בתא אטום לגזים. לאחר 3 דקות, הוציאו את העכבר מהחדר כאשר הוא מאבד תנועה רצונית למעט נשימה, ולאחר מכן עברו להרדמה רציפה על ידי צינור אף עם 2% איזופלורן.הערה: ידוע כי איזופלורן מפעיל מיקרוגליה. עם זאת, מכיוון שההדמיה מבוצעת 4 שבועות לאחר הניתוח, אין השפעה של איזופלורן על העכברים במהלך ההדמיה. למרות שהרדמה איזופלורנית משמשת למספר דקות כאשר עכברים מונחים במכשיר הסטריאוטקסי לפני הדמיה (שלב 4.2.1), מצאנו כי ההשפעה של הרדמה קצרה זו היא זניחה. במהלך הניתוח, שמור על העכבר חם עם כרית חימום ב 37 ° C כדי למנוע היפותרמיה. יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים למניעת יובש בקרנית ולתת זריקת מלוקסיקם, תת עורית (5 מ”ג/ק”ג). חבר את העכבר למוט אוזניים עזר, ולאחר מכן קבע את העכבר על המכשיר הסטריאוטקסי עם הצד הגבי שלו כלפי מעלה. התאמת ריכוז האיזופלורן לאחוז מתאים (1%-2%) במהלך הניתוח תוך ניטור הנשימה וקצב הלב. הסירו את השיער באמצעות קרם אפילציה וחיטאו את הראש מספר פעמים בתנועה סיבובית עם פילינג על בסיס יוד או כלורהקסידין ואלכוהול. לאחר מכן, להזריק 0.1 מ”ל של 1% לידוקאין תת עורית ולהחיל וילונות סטריליים כדי לאבטח את אתר הניתוח. חתכו את הקרקפת לאורך קו האמצע בעזרת מספריים ובצעו את החתך באורך של כ-2 ס”מ, כדי להבטיח חשיפה טובה של הגולגולת מעל קליפת המוח הראייתית הראשונית הימנית. לאחר החתך בקרקפת, השקו את הראש במי מלח לאורך כל ההליך כדי למנוע מהגולגולת והמוח החשופים להתייבש. הסר את periosteum על הגולגולת החשופה באמצעות מלקחיים. קדחו את הגולגולת על הקואורדינטות הסטריאוטקסיות: 3 מ”מ לרוחב לקו האמצע, 0.5 מ”מ קדמי לקו הלמדא, ליצירת חור קטן בקוטר של כ-0.5 מ”מ. יש לשטוף דם ושאריות רקמות מהמקדח, במידת הצורך. מלא את פיפטת הזכוכית ב- 1 μL של rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 באמצעות ההליך הבא בטיטר של 8.3 x 1012 גנומים וקטוריים/מ”ל22.מקדמים את המזרק כדי להוציא 1 μL של פרפין נוזלי מפיפטת הזכוכית. מניחים פיסת סרט שקוף, בגודל של כ-2X2 ס”מ, על גולגולת העכבר החשופה ומוציאים טיפה של 1 מיקרוליטר של תמיסת AAV על הסרט באמצעות פיפטר. הניחו את קצה פיפטת הזכוכית לתוך טיפת תמיסת AAV על הסרט ומשכו בעדינות את המזרק כדי לשאוף את תמיסת ה- AAV. לאחר הפליטה, סובב את הסטופרקוק בצורת T כדי לשחרר את הלחץ בתוך הצינור ואת פיפטת הזכוכית. הכניסו את פיפטת הזכוכית לעומק של 500 מיקרומטר מפני השטח של המוח דרך החור שנוצר בשלב 2.2.5, ואז הזריקו 0.5 מיקרוליטר של תמיסת AAV באמצעות המיקרו-מזרק (איור 1C). השתמש בקצב זרימת נפח ההזרקה של 2.0 μL / h; זריקה של 0.5 μL לוקח 15 דקות, ולאחר מכן לחכות 5 דקות. לאחר ההזרקה, למשוך בעדינות את פיפטת הזכוכית ולשטוף את משטח המוח עם מלוחים. 3. השתלת חלון גולגולת הערה: השתלת חלון גולגולת מתבצעת לאחר הזרקת AAV באותו היום. סמן עיגול בקוטר 2.5 מ”מ על הגולגולת, ממורכז 3 מ”מ לרוחב מהלמדא. צור חריץ עגול לאורך הסימן על הגולגולת על ידי קידוח. נקו את הפסולת מכיוון שהיא עלולה להשפיע לרעה על נראות הגולגולת ומרחו מלח במהלך תהליך הקידוח כדי למנוע התחממות. כדי לבדוק אם עומק הקידוח בחריץ המעגלי מספיק כדי להסיר את שבר הגולגולת המרכזי, לחץ בעדינות על הגולגולת המרכזית עם מלקחיים. אם הוא נע אנכית עם התנגדות קטנה, עומק הקידוח מספיק. כאשר החריץ מגיע לעומק מספיק, הכניסו את קצה המלקחיים לתחתית שבר הגולגולת המרכזי והרימו והוציאו אותו בעדינות כדי לחשוף את פני השטח של המוח (איור 1D). בעזרת מחט 27 גרם, דוקרים וקורעים את הדורה בקצה משטח המוח החשוף. הכנס את קצה המלקחיים דרך החור שנוצר בקצה הדורה. החזיקו את הדורה וקילפו אותה כדי לחשוף את פני השטח של המוח.הערה: אם מתרחש דימום, שטפו את משטח המוח במי מלח עד שהדימום ייפסק. בעזרת מלקחיים, מפזרים סיבים המוסטטיים בזה אחר זה במי מלח בכלי של 3.5 מ”מ, ולאחר מכן מניחים את הסיבים ההמוסטטיים לאורך שולי החור שבו נמצאת הדורה הטרנסקטית. הניחו חלון גולגולת שהוכן בשלב 1.3 על משטח המוח החשוף, ולאחר מכן הדביקו אותו לגולגולת בדבק מיידי תוך לחיצה עדינה על החלון כך שהחלון יהיה במגע הדוק עם הגולגולת. לאחר מכן, מרחו דבק מיידי על כל הגולגולת החשופה, ולאחר מכן חברו בזהירות לוחית ראש לגולגולת כך שהחלון ימוקם במרכז החור המרובע של לוחית הראש (איור 2C). ודא שפני השטח של לוח הראש מקבילים לפני השטח של חלון הזכוכית. לאחר שהדבק התקשה מספיק, מרחו מלט דנטלי על הגולגולת החשופה כדי לחזק את החיבור בין הראש ללוחית הראש (איור 2).הערה: אם הניסויים כוללים הצגת גירויים חזותיים לעכברים, יש להימנע מאור תועה לאזור ההדמיה. מומלץ להשחיר את המלט על ידי ערבובו עם הפחם הפעיל להפחתת השתקפות האור. מוציאים את העכבר מההרדמה לאחר שהמלט התקשה מספיק (כ-20 דקות). לאחר מכן, הכניסו את העכבר לכלוב חדש כדי להתאושש לבד. לאחר שאישר את הכרתו ואת תנועתו מרצון, המעידה על התאוששות מלאה, החזיר את העכבר לכלוב הביתי. במהלך ההתאוששות, לנהל מנה שנייה, או יותר במידת הצורך, meloxicam (פעם כל 24 שעות במשך 1-3 ימים) אם התנהגויות ברורות המציין כאב להתרחש. 4. In vivo הדמיה של שני פוטונים של מיקרוגליה ודינמיקה של סידן עצבי התרגלות עכברים למכשיר המיקרוסקופשלושה שבועות לאחר הניתוח, השר הרדמה בעכבר עם 3% איזופלורן, ומקם את העכבר מתחת לעדשת 25x אובייקטיבית של מיקרוסקופ שני פוטונים באמצעות מכשיר סטריאוטקסי מותאם אישית (איור 3C). עבור ההתקנה כאן, העכבר מוגדר על החלק העליון של הליכון מותר לרוץ בחופשיות. כ-10 דקות לאחר מכן, הוציאו את העכבר משלב המיקרוסקופ והחזירו אותו לכלוב הביתי. חזור על ההרגלה לפחות 3 פעמים בכל יום חלופי לפני רכישת תמונה של שני פוטונים. רכישת תמונה של שני פוטוניםהערה: אנו ממליצים לבצע את רכישת התמונה יותר מ -4 שבועות לאחר הניתוח, מכיוון שהפעלת מיקרוגליאה חוזרת בהדרגה לרמה הבסיסית.כמו בשלב 4.1, יש להשרות הרדמה בעכבר עם איזופלורן 3% ולהציב את העכבר מתחת לעדשת המטרה של המיקרוסקופ הדו-פוטוני באמצעות מכשיר סטריאוטקסי בהתאמה אישית. התקן הצללה בהתאמה אישית וצג LCD לגירוי חזותי כמתואר להלן (איור 3D).מקם את העדשה כך שתתמקד על פני השטח של המוח, ולאחר מכן הגדר מיקום עדשה זה כמיקום Z המקורי. שמור על קואורדינטות x-y קבועות והרם את העדשה האובייקטיבית; הסר את העכבר ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעדשה האובייקטיבית ומההליכון. חברו מכשיר הצללה לחלק העליון של פלטת הראש באמצעות סיליקון, אשר מושחר על ידי ערבוב עם אבקת פחם, וודאו שהרווח בין פלטת הראש למכשיר ההצללה אטום היטב. מלאו את מכשיר ההצללה במים מזוקקים, ולאחר מכן תקנו שוב את העכבר ואת המסגרת הסטריאוטקסית מתחת למטרה ועל ההליכון. אפסו בזהירות את מישור המוקד על פני המוח, בדקו את עומק עדשת המטרה.הערה: כדי למנוע את הסיכון של פגיעה בעדשת המטרה, הגדר תחילה את קואורדינטות xyz ולאחר מכן החל את התקן ההצללה של עדשת האובייקט. זה גם סביר להתקין את הכיסוי הראשון, ולאחר מכן להתאים את הקואורדינטות, אבל טיפול זהיר הכרחי עבור אפשרות זו. כסו את עדשת האובייקט ברדיד אלומיניום שחור כדי למנוע זיהום אור מצג ה-LCD המשמש לגירוי חזותי דרך עדשת האובייקט (איור 3D). הגדר צג LCD בגודל 10 אינץ’ בגודל 12.5 ס”מ מול עיני העכבר כדי להציג גירויים חזותיים (איור 3D). הגדר את מסנני איסוף הפליטה הפלואורסצנטית לפלואורסצנטיות EGFP (מסנן פליטה של 525/50 ננומטר) ולפלואורסצנטיות R-CaMP (מסנן פליטה של 593/46 ננומטר) ואת אורך גל העירור ל- 1,000 ננומטר. קבל תמונות ברזולוציה מרחבית של 0.25 מיקרומטר/פיקסל באמצעות יעד NA של 25x 1.1 ו-GaAsP PMTs. מצאו את אזור ההדמיה שבו ניתן לצלם בו-זמנית תאי עצב R-CaMP(+) ותאי מיקרוגליה מסוג EGFP(+) בשכבה 2/3. עבור מערך זה, הנתונים שהתקבלו באיור 4 ובווידאו 1 היו בעומק של 100 מיקרומטר מפני השטח של הפיאל, באמצעות תצוגה מקדימה של תמונה חיה. שמור על עוצמת לייזר עירור נמוכה ככל האפשר כדי למנוע הלבנת אור ונזק הנגרם על ידי טמפרטורה מקומית מוגברת באזור ההדמיה. קבל תמונות בקצב פריימים של 30 הרץ. במקביל לרכישת התמונה, הצג גירויים חזותיים נסחפים ב-100% ניגודיות, 1.5 הרץ, 0.04 מחזורים למעלה ב-12 כיוונים ב-6 כיוונים מ-0° עד 150° בצעדים של 30° לעכבר17. לאחר רכישת התמונה, הוציאו את העכבר משלב המיקרוסקופ, נתקו את מכשיר ההצללה ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעכבר והחזירו את העכבר לכלוב הביתי שלו. רישום נתוניםהמר ושמור את נתוני התמונה שנרכשו (תבנית nd2 במקרה זה) כסדרה של קובצי תמונה tiff לכל ערוץ צבע, באמצעות פיג’י או התוכנה שסופקה עם המיקרוסקופ. החל Turboreg, תוסף של פיג’י, כדי לבצע רישום עם מצב = תרגום. השתמשו בתמונה ממוצעת כתמונת הייחוס עם קובצי התמונה tiff של ערוץ EGFP. בצעו את העיבוד הבא עבור כל מסגרת באמצעות MATLAB.הערה: למרות ש- MATLAB משמש בעיבוד הבא, התיאור מתמקד בעיקר בכוונה של כל שלב, כך שניתן יהיה לנתח נתונים על ידי תוכנות תכנות אחרות כגון Python.השתמש בפונקציה imread כדי לקרוא שתי תמונות EGFP tiff לפני ואחרי רישום של אותה מסגרת, בהתאמה. השתמש בפונקציה imread כדי לקרוא את תמונת R-CaMP tiff של אותה מסגרת. השתמש בפונקציה normcorr2 כדי לחשב את פונקציית המתאם בין המשתנים הווקטוריים של שתי תמונות GFP שנקראו בשלב 4.3.3.1. השתמש בפונקציה max כדי לזהות את האינדקס הליניארי עם המתאם הצולב הגבוה ביותר של פונקציית המתאם, ולאחר מכן השתמש בפונקציה ind2sub כדי לחשב את מיקום התנועה של התמונה הרשומה מהתמונה המקורית שלה. השתמש בפונקציה imwarp כדי לתרגם את תמונת R-CaMP למיקום המחושב בשלב 4.3.3.3 ולאחר מכן השתמש בפונקציית הכתיבה כדי לשמור את התמונה הרשומה של R-CaMP. יצירת עקבות סידןבצעו את העיבוד הבא באמצעות MATLAB. השתמש בפונקציה imread כדי לקרוא את כל התמונות הרשומות של R-CaMP tiff שנוצרו בשלב 4.3.3.4. אם התמונות הרשומות כבר נטענו כמשתנה בסביבת העבודה, השמט שלב זה. השתמש בפונקציה mean כדי ליצור תמונת הקרנת זמן. השתמש בפונקציה imshow כדי להציג את התמונה הממוצעת כאיור; השתמש בפונקציה roipoly כדי ליצור מסיכת ROI בינארית של מבנה המטרה (עמוד השדרה הדנדריטי בנתונים אלה). באמצעות פונקציית הממוצע עם התמונות המתקבלות על ידי הכפלת המסיכה הבינארית בתמונות של כל מסגרת כמשתני קלט, חשב את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת בתוך החזר ההשקעה עבור כל מסגרת. כפי שתואר קודם לכן17, למשתנה המתקבל בשלב 4.4.3, יש להחיל את מסנן התדרים Butter worth בחיתוך = 1.6 שניות, לחיתוך רעש בתדר גבוה, ולאחר מכן להחיל את מסנן חציון הזזה בחלון הזמן = 200 שניות, לחיתוך רעש בתדר נמוך.