Gelijktijdige beeldvorming van microgliale dynamica en neuronale activiteit bij wakkere muizen

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee en de Genetic Recombinant Experiment Safety Committee van Graduate School of Medicine en Faculty of Medicine, de Universiteit van Tokio, en uitgevoerd volgens hun richtlijnen. 1. Voorbereiding Steriliseer alle instrumenten en apparaten die nodig zijn voor de operatie met behulp van autoclaaf of 70% ethanol. Voorbereiding van de glazen pipet.Bevestig een gekalibreerd capillair van 75 μL stevig aan de houder van de micropipettrekker. Stel de trekker in op het programma met de aanbevolen parameters als P (druk) = 500, WARMTE = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIJD = 180. Na het voltooien van het programma (meestal 4,5 tot 5 s), wordt het capillair verdeeld in twee glazen pipetten met taps toelopende staarten. Breek vervolgens het distale deel van de staarten met een pincet om de tipdiameter binnen 30-50 μm te houden. Breek hiervoor de staarten 1 cm distaal tot het einde van het afgeschuinde deel. Bereid voor craniotomie een schedelvenster voor door een grotere buitenste glazen schijf met een diameter van 4 mm, een dikte van 0,15 ± 0,02 mm te lijmen op een kleinere binnenste glazen schijf, een diameter van 2 mm, een dikte van 0,525 ± 0,075 mm, met behulp van een UV-lichtuithardingsreagens (figuur 2A). 2. AAV-injectie Voorbereiding van injectieapparatuurPlaats een glazen pipet die via een buis is aangesloten op een Hamilton-spuit van 26 G op een pipethouder van een stereotaxisch instrument en kantel de pipethouder vervolgens 60° anterieur vanaf de verticale as (figuur 1A,B). Vul de glazen pipet, de spuit en de verbindingsbuis met vloeibare paraffine. Plaats de spuit op een micro-injector. Chirurgische ingreepOPMERKING: De volgende operatie werd uitgevoerd in een gesteriliseerde cabine. Voor de operatie werd indien nodig een stereomicroscoop gebruikt.Verdoof een mannelijke CX3CR1-EGFP-muis (gedetailleerde informatie in de materiaaltabel) van 7 tot 8 weken oud (lichaamsgewicht 22-26 g) met 3% isofluraan in een gasdichte kamer. Haal na 3 minuten de muis uit de kamer wanneer deze de vrijwillige beweging verliest, behalve de ademhaling, en schakel dan over op continue anesthesie door een neussonde met 2% isofluraan.OPMERKING: Van isofluraan is bekend dat het microglia activeert. Omdat beeldvorming echter 4 weken na de operatie wordt uitgevoerd, is er geen effect van isofluraan op de muizen tijdens de beeldvorming. Hoewel isofluraananesthesie gedurende enkele minuten wordt gebruikt wanneer muizen in het stereotaxische instrument worden geplaatst voordat ze in beeld worden gebracht (stap 4.2.1), vonden we dat het effect van deze korte anesthesie verwaarloosbaar is. Houd de muis tijdens de operatie warm met een verwarmingskussen op 37 °C om onderkoeling te voorkomen. Breng oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen en dien een meloxicam-injectie toe, subcutaan (5 mg / kg). Bevestig de muis aan een hulpoorbalk en bevestig de muis vervolgens op het stereotaxische instrument met de dorsale kant naar boven. Pas de isofluraanconcentratie tijdens de operatie aan tot een geschikt percentage (1%-2%) terwijl u de ademhaling en hartslag controleert. Verwijder het haar met ontharingscrème en desinfecteer het hoofd meerdere keren in een cirkelvormige beweging met zowel een scrub op basis van jodium of chloorhexidine als alcohol. Injecteer vervolgens 0,1 ml 1% lidocaïne subcutaan en breng steriele gordijnen aan om de operatieplaats te beveiligen. Snijd de hoofdhuid open langs de middellijn met een schaar en maak de incisie ongeveer 2 cm lang, om een goede belichting van de schedel boven de rechter primaire visuele cortex te garanderen. Na de incisie van de hoofdhuid, irrigeer het hoofd met zoutoplossing gedurende de hele procedure om te voorkomen dat de blootgestelde schedel en hersenen uitdrogen. Verwijder het botysteum op de blootgestelde schedel met een tang. Boor de schedel op de stereotaxische coördinaten: 3 mm lateraal naar de middellijn, 0,5 mm voorzijde naar de lambdalijn, om een klein gat met ongeveer 0,5 mm diameter te creëren. Spoel indien nodig bloed en weefselresten van de boor af. Vul de glazen pipet met 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 volgens de volgende procedure bij een titer van 8,3 x 1012 vectorgenomen/ml22.Laat de spuit 1 μl vloeibare paraffine uit de glazen pipet werpen. Plaats een stuk transparante film, ongeveer 2 cm x 2 cm, op de blootgestelde schedel van de muis en verdrijf een druppel van 1 μL AAV-oplossing op de film met behulp van een pipettor. Plaats de punt van de glazen pipet in de druppel AAV-oplossing op de film en trek voorzichtig aan de spuit om de AAV-oplossing op te zuigen. Draai na het uitwerpen aan de T-vormige stopkraan om de druk in de buis en de glazen pipet los te laten. Steek de glazen pipet tot een diepte van 500 μm van het hersenoppervlak door het gat dat in stap 2.2.5 is gemaakt en injecteer vervolgens 0,5 μl AAV-oplossing met behulp van de micro-injector (figuur 1C). Gebruik het injectievolumedebiet van 2,0 μL/h; een injectie van 0,5 μL duurt 15 minuten en wacht vervolgens 5 minuten. Trek na de injectie voorzichtig de glazen pipet terug en spoel het hersenoppervlak af met een zoutoplossing. 3. Craniale raamimplantatie OPMERKING: Craniale raamimplantatie volgt op de AAV-injectie op dezelfde dag. Markeer een cirkel met een diameter van 2,5 mm op de schedel, gecentreerd op 3 mm zijdelings van de lambda. Maak een cirkelvormige groef langs de markering op de schedel door te boren. Reinig het puin omdat dit de zichtbaarheid van de schedel nadelig kan beïnvloeden en breng zoutoplossing aan tijdens het boorproces om opwarming te voorkomen. Om te controleren of de boordiepte in de cirkelvormige groef voldoende is om het centrale schedelfragment te verwijderen, drukt u voorzichtig met een tang op de centrale schedel. Als het verticaal beweegt met weinig weerstand, is de boordiepte voldoende. Wanneer de groef voldoende diep is, steekt u de punt van de tang in de onderkant van het centrale schedelfragment en tilt u deze voorzichtig op en verwijdert u deze om het hersenoppervlak bloot te leggen (figuur 1D). Gebruik een naald van 27 G om de dura aan de rand van het blootgestelde hersenoppervlak te prikken en te scheuren. Steek de punt van de tang door het gat aan de rand van de dura. Houd de dura vast en pel deze af om het hersenoppervlak bloot te leggen.OPMERKING: Als er een bloeding optreedt, spoel dan het hersenoppervlak met een zoutoplossing totdat het bloeden stopt. Dispergeer met behulp van een tang hemostatische vezels één voor één in zoutoplossing in een schaal van 3,5 mm en plaats vervolgens de hemostatische vezels langs de randen van het gat waarin de doorgesneden dura aanwezig is. Plaats een schedelvenster dat is voorbereid in stap 1.3 op het blootgestelde hersenoppervlak en hecht het vervolgens aan de schedel met onmiddellijke lijm terwijl u zachtjes op het venster drukt zodat het venster in nauw contact staat met de schedel. Breng daarna direct lijm aan op de hele blootgestelde schedel en bevestig vervolgens voorzichtig een hoofdplaat op de schedel, zodat het venster zich in het midden van het vierkante gat van de hoofdplaat bevindt (figuur 2C). Zorg ervoor dat het oppervlak van de kopplaat evenwijdig is aan het oppervlak van het glazen raam. Nadat de lijm voldoende is uitgehard, brengt u tandcement aan op de blootgestelde schedel om de aanhechting tussen het hoofd en de hoofdplaat te versterken (figuur 2).OPMERKING: Als de experimenten de presentatie van visuele stimuli aan muizen omvatten, moet strooilicht naar het beeldvormingsgebied worden vermeden. Het is raadzaam om het cement zwart te maken door het te mengen met de actieve kool voor de vermindering van lichtreflectie. Trek de muis uit de anesthesie nadat het cement voldoende is uitgehard (ongeveer 20 minuten). Plaats de muis vervolgens in een nieuwe kooi om alleen te herstellen. Na bevestiging van zijn bewustzijn en vrijwillige beweging, wat wijst op volledig herstel, plaats je de muis terug in de thuiskooi. Dien tijdens het herstel een tweede, of meer indien nodig, meloxicam-dosis toe (eenmaal per 24 uur gedurende 1-3 dagen) als duidelijk pijnaangevend gedrag optreedt. 4. In vivo beeldvorming van twee fotonen van microglia en neuronale calciumdynamica Gewenning van muizen aan het microscoopapparaatDrie weken na de operatie induceert u anesthesie bij de muis met 3% isofluraan en plaatst u de muis onder de 25x objectieve lens van een microscoop met twee fotonen met behulp van een op maat gemaakt stereotaxisch instrument (figuur 3C). Voor de opstelling hier wordt de muis op de bovenkant van een loopband geplaatst en mag hij vrij lopen. Verwijder ongeveer 10 minuten later de muis uit het microscoopstadium en breng deze terug naar de thuiskooi. Herhaal de gewenning minstens 3 keer om de andere dag voordat u twee fotonen beeldacquisitie. Beeldacquisitie met twee fotonenOPMERKING: We raden aan om de beeldacquisitie meer dan 4 weken na de operatie uit te voeren, omdat microgliale activering geleidelijk terugkeert naar het basale niveau.Induceer net als in stap 4.1 anesthesie in de muis met 3% isofluraan en plaats de muis onder de objectieflens van de tweefotonenmicroscoop met behulp van een op maat gemaakt stereotaxisch instrument. Installeer het op maat gemaakte zonweringsapparaat en een LCD-monitor voor visuele stimulatie zoals hieronder beschreven (figuur 3D).Plaats de lens om scherp te stellen op het hersenoppervlak en stel deze lenspositie vervolgens in als de oorspronkelijke Z-positie. Houd de x-y-coördinaten constant en verhef de objectieflens; Verwijder de muis en het stereotaxische instrument uit de objectieflens en loopband. Bevestig een schaduwapparaat aan de bovenkant van de kopplaat met siliconen, dat zwart wordt gemaakt door te mengen met houtskoolpoeder, en zorg ervoor dat de ruimte tussen de kopplaat en het schaduwapparaat goed is afgesloten. Vul het schaduwapparaat met gedestilleerd water en bevestig vervolgens de muis en het stereotaxische frame opnieuw onder het objectief en op de loopband. Reset zorgvuldig het brandpuntsvlak aan het hersenoppervlak en controleer de diepte van de objectieflens.OPMERKING: Om het risico van beschadiging van de objectieflens te voorkomen, stelt u eerst de xyz-coördinaten in en past u vervolgens de schaduwinrichting van de objectieflens toe. Het is ook redelijk om eerst de afdekking te installeren en vervolgens de coördinaten aan te passen, maar voorzichtige behandeling is noodzakelijk voor deze optie. Bedek de objectieflens met zwarte aluminiumfolie om lichtvervuiling te voorkomen van de LCD-monitor die wordt gebruikt voor visuele stimulatie door de objectieflens (figuur 3D). Stel een 10-inch LCD-monitor in op 12,5 cm voor de ogen van de muis om visuele stimuli te presenteren (figuur 3D). Configureer de fluorescentie-emissieopvangfilters naar EGFP-fluorescentie (525/50 nm-emissiefilter) en R-CaMP-fluorescentie (593/46 nm-emissiefilter) en de excitatiegolflengte tot 1.000 nm. Verkrijg beelden met een ruimtelijke resolutie van 0,25 μm/pixel met behulp van een 25x 1,1 NA-objectief en GaAsP PMT’s. Zoek het beeldvormingsgebied waarin R-CaMP(+)-neuronen en EGFP(+)-microglia gelijktijdig kunnen worden afgebeeld in laag 2/3. Voor deze opstelling bevonden de gegevens verkregen in figuur 4 en video 1 zich op een diepte van 100 μm van het piale oppervlak, met behulp van een live beeldvoorbeeld. Houd het vermogen van de excitatielaser zo laag mogelijk om fotobleken en schade veroorzaakt door verhoogde lokale temperatuur in het beeldgebied te voorkomen. Verkrijg beelden met een framesnelheid van 30 Hz. Presenteer gelijktijdig met de beeldacquisitie een drijvend-roosterende visuele stimuli bij 100% contrast, 1,5 Hz, 0,04 cycli per graad in 12 richtingen in 6 oriëntaties van 0 ° tot 150 ° in stappen van 30 ° naar de muis17. Verwijder na de beeldacquisitie de muis uit het microscoopstadium, maak het schaduwapparaat en het stereotaxische instrument los van de muis en breng de muis terug naar zijn thuiskooi. GegevensregistratieConverteer en sla de verkregen beeldgegevens (nd2-formaat in dit geval) op als een reeks tiff-afbeeldingsbestanden voor elk kleurkanaal, met behulp van Fiji of de software die bij de microscoop wordt geleverd. Pas Turboreg toe, een plug-in van Fiji, om registratie uit te voeren met mode = vertaling. Gebruik de gemiddelde afbeelding als referentieafbeelding met de tiff-afbeeldingsbestanden van het EGFP-kanaal. Voer de volgende verwerking uit voor elk frame met MATLAB.OPMERKING: Hoewel MATLAB wordt gebruikt in de volgende verwerking, richt de beschrijving zich voornamelijk op de intentie van elke stap, zodat gegevens kunnen worden geanalyseerd door andere programmeersoftware zoals Python.Gebruik de imread-functie om respectievelijk twee EGFP tiff-afbeeldingen voor en na registratie van hetzelfde frame te lezen. Gebruik de imread-functie om de R-CaMP tiff-afbeelding van hetzelfde frame te lezen. Gebruik de functie normcorr2 om de correlatiefunctie te berekenen tussen de gevectoriseerde variabelen van de twee GFP-afbeeldingen die in stap 4.3.3.1 zijn gelezen. Gebruik de functie max om de lineaire index met de hoogste kruiscorrelatie van de correlatiefunctie te detecteren en gebruik vervolgens de functie ind2sub om de bewegingspositie van de geregistreerde afbeelding te berekenen op basis van de oorspronkelijke afbeelding. Gebruik de imwarp-functie om de R-CaMP-afbeelding te vertalen naar de positie die is berekend in stap 4.3.3.3 en gebruik vervolgens de imwrite-functie om de geregistreerde afbeelding van R-CaMP op te slaan. Aanmaak van calciumsporenVoer de volgende verwerking uit met MATLAB. Gebruik de imread-functie om alle geregistreerde R-CaMP tiff-afbeeldingen te lezen die in stap 4.3.3.4 zijn gegenereerd. Als de geregistreerde afbeeldingen al als variabele in de werkruimte zijn geladen, laat u deze stap weg. Gebruik de functie gemiddelde om een tijdprojectiebeeld te genereren. Gebruik de imshow-functie om de gemiddelde afbeelding als een figuur weer te geven; gebruik de Roipoly-functie om een binair ROI-masker van de doelstructuur te genereren (dendritische wervelkolom in deze gegevens). Gebruik de gemiddelde functie met de afbeeldingen die worden verkregen door het binaire masker te vermenigvuldigen met afbeeldingen van elk frame als invoervariabelen, en bereken de gemiddelde fluorescentie-intensiteit binnen de ROI voor elk frame. Zoals eerder beschreven17, past u op de in stap 4.4.3 verkregen variabele het boterfrequentiefilter toe bij afsnijding = 1,6 s voor het snijden van hoogfrequent geluid en past u vervolgens het glijdende middenfilter toe op het tijdvenster = 200 s, voor het snijden van laagfrequent geluid.