Одновременная визуализация динамики микроглии и активности нейронов у бодрствующих мышей

Все эксперименты были одобрены Комитетом по этике животных и Комитетом по безопасности генетических рекомбинантных экспериментов Высшей школы медицины и медицинского факультета Токийского университета и выполнены в соответствии с их рекомендациями. 1. Подготовка Стерилизуйте все инструменты и аппараты, необходимые для операции, с помощью автоклава или 70% этанола. Приготовление стеклянной пипетки.Надежно закрепите калиброванный капилляр объемом 75 мкл на держателе съемника микропипетки. Установите съемник в программу с рекомендуемыми параметрами P (давление) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180. После окончания программы (обычно от 4,5 до 5 с) капилляр разделяют на две стеклянные пипетки с сужающимися хвостиками. Затем разбейте пинцетом дистальную часть хвостов, чтобы диаметр кончика не превышал 30-50 мкм. Для этого разломайте хвостики на 1 см дистальнее конца скошенной части. Для трепанации черепа подготовьте черепное окно, приклеив больший внешний стеклянный диск диаметром 4 мм, толщиной 0,15 ± 0,02 мм к меньшему внутреннему стеклянному диску диаметром 2 мм, толщиной 0,525 ± 0,075 мм с использованием реагента для отверждения ультрафиолетовым светом (рис. 2A). 2. Впрыск AAV Подготовка инъекционного аппаратаПоместите стеклянную пипетку, соединенную со шприцем Гамильтона 26 г через трубку, на держатель пипетки стереотаксического инструмента, а затем наклоните держатель пипетки на 60° вперед от вертикальной оси (рис. 1A, B). Наполните стеклянную пипетку, шприц и соединительную трубку жидким парафином. Поместите шприц на микроинжектор. Хирургическое вмешательствоПРИМЕЧАНИЕ: Следующая операция была выполнена в стерилизованной кабине. При необходимости для операции использовался стереомикроскоп.Анестезировать самца мыши CX3CR1-EGFP (подробная информация в таблице материалов) в возрасте от 7 до 8 недель (масса тела 22-26 г) 3% изофлураном в газонепроницаемой камере. Через 3 мин выньте мышь из камеры, когда она потеряет произвольное движение, кроме дыхания, а затем переключитесь на непрерывную анестезию назальной трубкой с 2% изофлураном.ПРИМЕЧАНИЕ: Известно, что изофлуран активирует микроглию. Однако, поскольку визуализация проводится через 4 недели после операции, изофлуран не оказывает влияния на мышей во время визуализации. Хотя изофлурановая анестезия используется в течение нескольких минут, когда мышей помещают в стереотаксический инструмент перед визуализацией (этап 4.2.1), мы обнаружили, что эффект этой короткой анестезии незначителен. Во время операции держите мышь в тепле с помощью грелки при температуре 37 °C, чтобы предотвратить переохлаждение. Нанесите глазную мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость роговицы, и введите инъекцию мелоксикама подкожно (5 мг / кг). Прикрепите мышь к вспомогательной ушной планке, а затем закрепите мышь на стереотаксическом инструменте тыльной стороной вверх. Отрегулируйте концентрацию изофлурана до соответствующего процента (1-2%) во время операции, контролируя дыхание и частоту сердечных сокращений. Удалите волосы с помощью крема для депиляции и продезинфицируйте голову несколько раз круговыми движениями скрабом на основе йода или хлоргексидина и спиртом. Затем введите 0,1 мл 1% лидокаина подкожно и наложите стерильные простыни, чтобы закрепить место операции. Надрежьте кожу головы ножницами по средней линии и сделайте разрез длиной около 2 см, чтобы обеспечить хорошее обнажение черепа над правой первичной зрительной корой. После разреза кожи головы орошите голову физиологическим раствором на протяжении всей процедуры, чтобы предотвратить высыхание обнаженного черепа и мозга. Удалите надкостницу на обнаженном черепе с помощью щипцов. Просверлите череп по стереотаксическим координатам: 3 мм сбоку от средней линии, 0,5 мм спереди лямбда-линии, чтобы создать небольшое отверстие диаметром примерно 0,5 мм. При необходимости смойте кровь и остатки тканей со сверла. Заполните стеклянную пипетку 1 мкл rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07, используя следующую процедуру при титре 8,3 x 1012 векторных геномов/мл22.Продвиньте шприц, чтобы вытолкнуть 1 мкл жидкого парафина из стеклянной пипетки. Поместите кусок прозрачной пленки размером примерно 2 см х 2 см на открытый череп мыши и вытесните каплю 1 мкл раствора AAV на пленку с помощью пипетки. Поместите стеклянный наконечник пипетки в каплю раствора AAV на пленке и осторожно потяните шприц, чтобы аспирировать раствор AAV. После выброса поверните Т-образный запорный кран, чтобы сбросить давление внутри трубки и стеклянной пипетки. Вставьте стеклянную пипетку на глубину 500 мкм от поверхности мозга через отверстие, созданное на шаге 2.2.5, а затем введите 0,5 мкл раствора AAV с помощью микроинжектора (рис. 1C). Используйте объемный расход впрыска 2,0 мкл / ч; инъекция 0,5 мкл занимает 15 мин, а затем ждать 5 мин. После инъекции аккуратно извлеките стеклянную пипетку и промойте поверхность мозга физиологическим раствором. 3. Имплантация черепного окна ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантация черепного окна следует за инъекцией AAV в тот же день. Отметьте на черепе круг диаметром 2,5 мм, расположенный по центру на расстоянии 3 мм сбоку от лямбды. Создайте круглую канавку вдоль отметины на черепе с помощью сверления. Очистите мусор, так как это может отрицательно повлиять на видимость черепа, и нанесите физиологический раствор во время процесса сверления, чтобы предотвратить нагрев. Чтобы проверить, достаточна ли глубина сверления в круглой канавке для удаления центрального фрагмента черепа, аккуратно прижмите центральный череп щипцами. Если он движется вертикально с небольшим сопротивлением, глубина бурения достаточна. Когда бороздка достигнет достаточной глубины, вставьте кончик щипцов в нижнюю часть центрального фрагмента черепа, осторожно поднимите и извлеките его, чтобы обнажить поверхность мозга (рис. 1D). Используя иглу 27 G, уколите и разорвите твердую мозговую оболочку на краю открытой поверхности мозга. Вставьте кончик щипцов через отверстие, сделанное на краю твердой мозговой оболочки. Возьмитесь за твердую мозговую оболочку и снимите ее, чтобы обнажить поверхность мозга.ПРИМЕЧАНИЕ: Если происходит кровотечение, промойте поверхность мозга физиологическим раствором до тех пор, пока кровотечение не остановится. С помощью щипцов рассредоточите гемостатических волокон одно за другим в физиологическом растворе в чашке диаметром 3,5 мм, а затем поместите гемостатических волокон по краям отверстия, в котором присутствует пересеченная твердая мозговая оболочка. Поместите черепное окно, подготовленное на шаге 1.3, на открытую поверхность мозга, а затем приклейте его к черепу с помощью мгновенного клея, осторожно нажимая на окно, чтобы окно находилось в тесном контакте с черепом. После этого нанесите мгновенный клей на весь открытый череп, а затем осторожно прикрепите головную пластину к черепу так, чтобы окно находилось в центре квадратного отверстия головной пластины (рис. 2C). Убедитесь, что поверхность головной пластины параллельна поверхности стеклянного окна. После того, как клей достаточно затвердеет, нанесите стоматологический цемент на обнаженный череп, чтобы укрепить крепление между головой и головной пластиной (рис. 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Если эксперименты включают представление визуальных стимулов мышам, следует избегать рассеянного света в область визуализации. Желательно почернить цемент, смешав его с активированным углем для уменьшения отражения света. Извлеките мышь из анестезии после того, как цемент достаточно затвердеет (около 20 мин). Затем поместите мышь в новую клетку, чтобы она восстановилась в одиночестве. После подтверждения ее сознания и произвольного движения, свидетельствующего о полном выздоровлении, поместите мышь обратно в домашнюю клетку. Во время выздоровления вводите вторую или, при необходимости, более дозу мелоксикама (один раз каждые 24 часа в течение 1-3 дней), если возникают очевидные симптомы, указывающие на боль. 4. Двухфотонная визуализация микроглии и динамики кальция в нейронах in vivo Привыкание мышей к аппарату микроскопаЧерез три недели после операции наведите на мышь анестезию 3% изофлураном и поместите мышь под 25-кратный объектив двухфотонного микроскопа с помощью специально изготовленного стереотаксического прибора (рис. 3C). Для настройки здесь мышь устанавливается на верхнюю часть беговой дорожки и может свободно бегать. Примерно через 10 минут извлеките мышь из предметного столика микроскопа и верните ее в домашнюю клетку. Повторяйте привыкание не менее 3 раз через день перед получением двухфотонного изображения. Получение двухфотонных изображенийПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем проводить получение изображения более чем через 4 недели после операции, так как активация микроглии постепенно возвращается к базальному уровню.Как и на шаге 4.1, индуцируют анестезию у мыши 3% изофлураном и устанавливают мышь под линзу объектива двухфотонного микроскопа с помощью изготовленного на заказ стереотаксического прибора. Установите изготовленное на заказ затеняющее устройство и ЖК-монитор для визуальной стимуляции, как описано ниже (рис. 3D).Расположите линзу так, чтобы она сфокусировалась на поверхности мозга, а затем установите это положение объектива в исходное положение Z. Сохраняйте координаты x-y постоянными и поднимите линзу объектива; Извлеките мышь и стереотаксический прибор из линзы объектива и беговой дорожки. Прикрепите затеняющее устройство к верхней части головной пластины с помощью силикона, который чернеет путем смешивания с порошком древесного угля, и убедитесь, что пространство между головной пластиной и затеняющим устройством хорошо закрыто. Наполните затеняющее устройство дистиллированной водой, а затем снова закрепите мышь и стереотаксическую рамку под объективом и на беговой дорожке. Аккуратно сбросьте фокальную плоскость на поверхности мозга, проверив глубину линзы объектива.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать риска повреждения объектива, сначала установите координаты xyz, а затем примените затеняющее устройство объектива. Также разумно сначала установить крышку, а потом корректировать координаты, но для этого варианта необходимо осторожное обращение. Накройте линзу объектива черной алюминиевой фольгой, чтобы избежать загрязнения света от ЖК-монитора, используемого для визуальной стимуляции через линзу объектива (рис. 3D). Установите 10-дюймовый ЖК-монитор на расстоянии 12,5 см перед глазами мыши для отображения визуальных стимулов (рис. 3D). Настройте фильтры сбора флуоресцентного излучения на флуоресценцию EGFP (эмиссионный фильтр 525/50 нм) и флуоресценцию R-CaMP (эмиссионный фильтр 593/46 нм) и длину волны возбуждения до 1,000 нм. Получение изображений с пространственным разрешением 0,25 мкм/пиксель с помощью объектива 25x 1,1 NA и ФЭУ GaAsP. Найдите область визуализации, в которой нейроны R-CaMP (+) и микроглия EGFP (+) могут быть одновременно визуализированы в слое 2/3. Для этой установки данные, полученные на рисунке 4 и видео 1 , находились на глубине 100 мкм от поверхности пиала с использованием предварительного просмотра изображения в реальном времени. Держите мощность возбуждающего лазера как можно ниже, чтобы избежать фотообесцвечивания и повреждений, вызванных повышенной локальной температурой в области изображения. Получайте изображения с частотой кадров 30 Гц. Одновременно с получением изображения представьте дрейфующие визуальные стимулы с 100% контрастностью, 1,5 Гц, 0,04 цикла на градус в 12 направлениях при 6 ориентациях от 0° до 150° с шагом 30° к мыши17. После получения изображения извлеките мышь из предметного столика микроскопа, отсоедините затеняющее устройство и стереотаксический инструмент от мыши и верните мышь в домашнюю клетку. Регистрация данныхПреобразуйте и сохраните полученные данные изображения (в данном случае формат nd2) в виде серии файлов изображений tiff для каждого цветового канала, используя Fiji или программное обеспечение, поставляемое с микроскопом. Примените Turboreg, плагин Фиджи, для выполнения регистрации с mode = translation. Используйте усредненное изображение в качестве эталонного изображения с файлами изображений tiff канала EGFP. Выполните следующую обработку для каждого кадра с помощью MATLAB.ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя MATLAB используется в следующей обработке, описание в основном фокусируется на намерении каждого шага, чтобы данные могли быть проанализированы другим программным обеспечением, таким как Python.Используйте функцию imread для чтения двух изображений EGFP tiff до и после регистрации одного и того же кадра соответственно. Используйте функцию imread для чтения изображения R-CaMP tiff того же кадра. Используйте функцию normcorr2 для вычисления функции корреляции между векторизованными переменными двух изображений GFP, прочитанных на шаге 4.3.3.1. Используйте функцию max для определения линейного индекса с наибольшей перекрестной корреляцией корреляционной функции, а затем используйте функцию ind2sub для вычисления положения движения зарегистрированного изображения по исходному изображению. Используйте функцию imwarp для преобразования изображения R-CaMP в положение, рассчитанное на шаге 4.3.3.3, а затем используйте функцию imwrite для сохранения зарегистрированного изображения R-CaMP. Образование следов кальцияВыполните следующую обработку с помощью MATLAB. Используйте функцию imread для чтения всех зарегистрированных изображений R-CaMP tiff, сгенерированных на шаге 4.3.3.4. Если зарегистрированные изображения уже загружены в качестве переменной в рабочую область, пропустите этот шаг. Используйте функцию среднего значения для создания изображения временной проекции. Используйте функцию imshow, чтобы отобразить усредненное изображение в виде рисунка; используйте функцию roipoly для создания двоичной маски ROI целевой структуры (дендритный позвоночник в этих данных). Используя функцию среднего с изображениями, полученными путем умножения двоичной маски на изображения каждого кадра в качестве входных переменных, вычислите усредненную интенсивность флуоресценции в пределах ROI для каждого кадра. Как описано ранее17, к переменной, полученной на шаге 4.4.3, примените частотный фильтр стоимости сливочного масла при отсечке = 1,6 с, для резки высокочастотного шума, а затем примените скользящий медианный фильтр на временном окне = 200 с, для сокращения низкочастотного шума.