Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Tüm deneyler Tokyo Üniversitesi Tıp Fakültesi ve Tıp Fakültesi Hayvan Etik Komitesi ve Genetik Rekombinant Deney Güvenliği Komitesi tarafından onaylanmış ve kılavuzlarına göre gerçekleştirilmiştir. 1. Hazırlık Ameliyat için gerekli tüm alet ve aparatları otoklav veya% 70 etanol kullanarak sterilize edin. Cam pipet hazırlama.75 μL kalibre edilmiş kılcal damarı mikropipet çektiricinin tutucusuna sıkıca sabitleyin. Çektirmeyi önerilen parametrelerle programa P (basınç) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180 olarak ayarlayın. Programı bitirdikten sonra (genellikle 4,5 ila 5 sn), kılcal damar sivrilen kuyruklara sahip iki cam pipete bölünür. Ardından, uç çapını 30-50 μm arasında tutmak için kuyrukların distal kısmını cımbızla kırın. Bunun için kuyrukları eğimli kısmın sonuna kadar 1 cm distal olarak kırın. Kraniotomi için, UV ışık kürleme reaktifi kullanarak 4 mm çapında, 0,15 ± 0,02 mm kalınlığında daha büyük bir dış cam diski, 2 mm çapında, 0,525 ± 0,075 mm kalınlığında daha küçük bir iç cam diske yapıştırarak bir kranial pencere hazırlayın (Şekil 2A). 2. AAV enjeksiyonu Enjeksiyon aparatının hazırlanması26 G Hamilton şırıngasına bağlı bir cam pipeti bir tüpün içinden stereotaksik bir cihazın pipet tutucusuna yerleştirin ve ardından pipet tutucuyu dikey eksenden 60° öne doğru eğin (Şekil 1A,B). Cam pipeti, şırıngayı ve bağlantı borusunu sıvı parafin ile doldurun. Şırıngayı bir mikroenjektöre yerleştirin. Cerrahi prosedürNOT: Aşağıdaki ameliyat sterilize edilmiş bir kabinde yapıldı. Gerekirse ameliyat için stereomikroskop kullanıldı.Bir erkek CX3CR1-EGFP faresini (Malzeme Tablosunda ayrıntılı bilgi) 7 ila 8 haftalıkken (vücut ağırlığı 22-26 g) gaz geçirmez bir odada% 3 izofluran ile uyuşturun. 3 dakika sonra, nefes alma dışında gönüllü hareketini kaybettiğinde fareyi odadan çıkarın ve% 2 izofluran içeren bir burun tüpü ile sürekli anesteziye geçin.NOT: İzoflurane’nin mikroglia’yı aktive ettiği bilinmektedir. Ancak görüntüleme ameliyattan 4 hafta sonra yapıldığı için görüntüleme sırasında izofluranın fareler üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. İzofluran anestezisi, görüntülemeden önce fareler stereotaksik alete yerleştirildiğinde birkaç dakika boyunca kullanılmasına rağmen (adım 4.2.1), bu kısa anestezinin etkisinin ihmal edilebilir olduğunu bulduk. Ameliyat sırasında, hipotermiyi önlemek için fareyi 37 ° C’de bir ısıtma yastığı ile sıcak tutun. Kornea kuruluğunu önlemek için her iki göze göz merhemi uygulayın ve deri altından (5 mg / kg) meloksikam enjeksiyonu uygulayın. Fareyi yardımcı bir kulak çubuğuna takın ve ardından fareyi sırt tarafı yukarı bakacak şekilde stereotaksik aletin üzerine sabitleyin. Nefes ve kalp atış hızını izlerken ameliyat sırasında izofluran konsantrasyonunu uygun bir yüzdeye (% 1 -% 2) ayarlayın. Tüy dökücü krem kullanarak saçları çıkarın ve kafayı hem iyot bazlı hem de klorheksidin bazlı bir ovma ve alkol ile dairesel bir hareketle birkaç kez dezenfekte edin. Daha sonra, deri altından 0.1 mL% 1 lidokain enjekte edin ve cerrahi bölgeyi güvence altına almak için steril örtüler uygulayın. Kafa derisini orta hat boyunca makasla açın ve kafatasının sağ birincil görsel korteksin üzerinde iyi bir şekilde pozlanmasını sağlamak için insizyonu yaklaşık 2 cm uzunluğunda yapın. Kafa derisinin kesilmesinden sonra, maruz kalan kafatası ve beynin kurumasını önlemek için tüm prosedür boyunca kafayı salinle sulayın. Forseps kullanarak açıkta kalan kafatası üzerindeki periosteumu çıkarın. Kafatasını stereotaksik koordinatlar üzerinde delin: yaklaşık 0,5 mm çapında küçük bir delik oluşturmak için orta hatta 3 mm yanal, lambda hattına 0,5 mm önde. Gerekirse, matkap ucundaki kan ve doku kalıntılarını durulayın. Aşağıdaki prosedürü kullanarak cam pipeti 8,3 x 1012 vektör genomu/mL22 titresinde 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 ile doldurun.Cam pipetten 1 μL sıvı parafin çıkarmak için şırıngayı ilerletin. Farenin açıkta kalan kafatasına yaklaşık 2 cm x 2 cm’lik bir şeffaf film parçası yerleştirin ve bir pipetör kullanarak film üzerine 1 μL AAV çözeltisinden oluşan bir damlacık atın. Cam pipet ucunu film üzerindeki AAV çözeltisinin damlacığına yerleştirin ve AAV çözeltisini aspire etmek için şırıngayı yavaşça çekin. Çıkarma işleminden sonra, tüpün ve cam pipetin içindeki basıncı serbest bırakmak için T şeklindeki stopcock’u çevirin. Cam pipeti, adım 2.2.5’te oluşturulan delikten beyin yüzeyinden 500 μm derinliğe yerleştirin ve ardından mikroenjektörü kullanarak 0,5 μL AAV çözeltisi enjekte edin (Şekil 1C). 2,0 μL/s enjeksiyon hacmi akış hızını kullanın; 0.5 μL’lik bir enjeksiyon 15 dakika sürer ve daha sonra 5 dakika bekleyin. Enjeksiyondan sonra, cam pipeti yavaşça geri çekin ve beyin yüzeyini salinle durulayın. 3. Kraniyal pencere implantasyonu NOT: Kraniyal pencere implantasyonu aynı gün AAV enjeksiyonunu takip eder. Kafatası üzerinde, lambdadan yanal olarak 3 mm ortalanmış 2,5 mm çapında bir daireyi işaretleyin. Delerek kafatası üzerindeki işaret boyunca dairesel bir oluk oluşturun. Kafatasının görünürlüğünü olumsuz yönde etkileyebileceğinden kalıntıları temizleyin ve ısınmayı önlemek için delme işlemi sırasında salin uygulayın. Dairesel oluktaki delme derinliğinin merkezi kafatası parçasını çıkarmak için yeterli olup olmadığını kontrol etmek için, merkezi kafatasına forseps ile hafifçe bastırın. Çok az dirençle dikey olarak hareket ederse, sondaj derinliği yeterlidir. Oluk yeterli derinliğe ulaştığında, forsepsin ucunu merkezi kafatası parçasının dibine yerleştirin ve beyin yüzeyini ortaya çıkarmak için yavaşça kaldırın ve çıkarın (Şekil 1D). 27 G’lik bir iğne kullanarak, açıkta kalan beyin yüzeyinin kenarındaki durayı delin ve yırtın. Forsepsin ucunu duranın kenarında yapılan delikten geçirin. Dura’yı tutun ve beyin yüzeyini ortaya çıkarmak için soyun.NOT: Kanama meydana gelirse, kanama durana kadar beyin yüzeyini salinle durulayın. Forseps kullanarak, hemostatik lifleri 3.5 mm’lik bir tabakta tuzlu su içinde birer birer dağıtın ve ardından hemostatik lifleri, transekte duranın bulunduğu deliğin kenarları boyunca yerleştirin. Maruz kalan beyin yüzeyine adım 1.3’te hazırlanan bir kafatası penceresi yerleştirin ve ardından pencerenin kafatası ile yakın temas halinde olması için pencereye hafifçe bastırırken anında yapıştırıcı ile kafatasına yapıştırın. Daha sonra, açıkta kalan kafatasının tamamına anında yapıştırıcı uygulayın ve ardından kafatasına dikkatlice bir kafa plakası takın, böylece pencere kafa plakasının kare deliğinin merkezinde bulunur (Şekil 2C). Kafa plakasının yüzeyinin cam pencerenin yüzeyine paralel olduğundan emin olun. Tutkal yeterince sertleştikten sonra, baş ve kafa plakası arasındaki bağlantıyı güçlendirmek için açıkta kalan kafatasına diş çimentosu uygulayın (Şekil 2).NOT: Deneyler farelere görsel uyaranların sunumunu içeriyorsa, görüntüleme alanına giden başıboş ışıktan kaçınılmalıdır. Işık yansımasının azaltılması için çimentonun aktif kömürle karıştırılarak karartılması tavsiye edilir. Çimento yeterince sertleştikten sonra fareyi anesteziden çekin (yaklaşık 20 dakika). Ardından, tek başına iyileşmek için fareyi yeni bir kafese koyun. Bilincini ve gönüllü hareketini doğruladıktan sonra, tam iyileşmeyi göstererek, fareyi tekrar ev kafesine koyun. İyileşme sırasında, bariz ağrı gösteren davranışlar ortaya çıkarsa, ikinci veya gerekirse daha fazla meloksikam dozu (1-3 gün boyunca her 24 saatte bir) uygulayın. 4. Mikroglia ve nöronal kalsiyum dinamiklerinin in vivo iki foton görüntülemesi Farelerin mikroskop aparatına alışmasıAmeliyattan üç hafta sonra, farede% 3 izofluran ile anestezi uygulayın ve fareyi özel yapım stereotaksik bir alet kullanarak iki fotonlu bir mikroskobun 25x objektif lensinin altına yerleştirin (Şekil 3C). Buradaki kurulum için, fare bir koşu bandının üstüne yerleştirilir ve serbestçe çalışmasına izin verilir. Yaklaşık 10 dakika sonra, fareyi mikroskop aşamasından çıkarın ve ev kafesine geri getirin. İki fotonlu görüntü elde etmeden önce alışkanlığı her alternatif günde en az 3 kez tekrarlayın. İki fotonlu görüntü yakalamaNOT: Mikroglial aktivasyon yavaş yavaş bazal seviyeye geri döndüğünden, görüntü alımını ameliyattan 4 haftadan daha uzun bir süre sonra yapmanızı öneririz.Adım 4.1’de olduğu gibi,% 3 izofluran ile farede anestezi sağlayın ve özel yapım stereotaksik bir alet kullanarak fareyi iki foton mikroskobunun objektif merceğinin altına yerleştirin. Aşağıda açıklandığı gibi görsel stimülasyon için özel yapım gölgelendirme cihazını ve bir LCD monitörü takın (Şekil 3D).Lensi beyin yüzeyine odaklanacak şekilde konumlandırın ve ardından bu lens konumunu orijinal Z konumu olarak ayarlayın. x-y koordinatlarını sabit tutun ve objektif lensi yükseltin; Fareyi ve stereotaksik aleti objektif lensten ve koşu bandından çıkarın. Kömür tozu ile karıştırılarak karartılan silikon kullanarak kafa plakasının üstüne bir gölgelendirme cihazı takın ve kafa plakası ile gölgelendirme cihazı arasındaki boşluğun iyi kapatıldığından emin olun. Gölgelendirme cihazını damıtılmış suyla doldurun ve ardından fareyi ve stereotaksik çerçeveyi hedefin altına ve koşu bandına tekrar sabitleyin. Objektif lensin derinliğini kontrol ederek beyin yüzeyindeki odak düzlemini dikkatlice sıfırlayın.NOT: Objektif lense zarar verme riskini önlemek için, önce xyz koordinatlarını ayarlayın ve ardından objektif lensin gölgelendirme cihazını uygulayın. Önce kapağı takmak ve ardından koordinatları ayarlamak da mantıklıdır, ancak bu seçenek için dikkatli kullanım gereklidir. Objektif lens aracılığıyla görsel stimülasyon için kullanılan LCD monitörden kaynaklanan ışık kirliliğini önlemek için objektif lensi siyah alüminyum folyo ile örtün (Şekil 3D). Görsel uyaranları sunmak için farenin gözlerinin önünde 12,5 cm’lik 10 inçlik bir LCD monitör ayarlayın (Şekil 3D). Floresan emisyon toplama filtrelerini EGFP floresan (525/50 nm emisyon filtresi) ve R-CaMP floresan (593/46 nm emisyon filtresi) ve uyarma dalga boyunu 1.000 nm olarak yapılandırın. 25×1,1 NA hedefi ve GaAsP PMT’leri kullanarak 0,25 μm/piksel uzamsal çözünürlüğe sahip görüntüler elde edin. R-CaMP (+) nöronlarının ve EGFP (+) mikroglia’nın aynı anda katman 2/3’te görüntülenebileceği görüntüleme bölgesini bulun. Bu kurulum için, Şekil 4 ve Video 1’de elde edilen veriler, canlı görüntü önizlemesi kullanılarak pial yüzeyinden 100 μm derinlikteydi. Foto-beyazlatma ve görüntüleme bölgesindeki artan yerel sıcaklığın neden olduğu hasarı önlemek için uyarma lazerinin gücünü mümkün olduğunca düşük tutun. Görüntü yakalama ile eşzamanlı olarak, fareye 30° adımlarla 0° ila 150° arasında 6 yönde 12 yönde% 100 kontrastta, 1,5 Hz, derece başına 0,04 döngüde sürüklenen ızgaralı bir görsel uyaran sunun17. Görüntü alımından sonra, fareyi mikroskop aşamasından çıkarın, gölgeleme cihazını ve stereotaksik aleti fareden ayırın ve fareyi ev kafesine geri getirin. Veri kaydıElde edilen görüntü verilerini (bu durumda nd2 formatı), Fiji’yi veya mikroskopla birlikte verilen yazılımı kullanarak her renk kanalı için bir dizi tiff görüntü dosyası olarak dönüştürün ve kaydedin. Mode = translation ile kayıt yapmak için Fiji’nin bir eklentisi olan Turboreg’i uygulayın. Ortalama görüntüyü EGFP kanalının tiff görüntü dosyalarıyla referans görüntü olarak kullanın. MATLAB kullanarak her kare için aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin.NOT: Aşağıdaki işlemlerde MATLAB kullanılmasına rağmen, açıklama esas olarak her adımın amacına odaklanır, böylece veriler Python gibi diğer programlama yazılımları tarafından analiz edilebilir.Aynı karenin kaydından önce ve sonra sırasıyla iki EGFP tiff görüntüsünü okumak için imread işlevini kullanın. Aynı karenin R-CaMP tiff görüntüsünü okumak için imread işlevini kullanın. Adım 4.3.3.1’de okunan iki GFP görüntüsünün vektörize değişkenleri arasındaki korelasyon fonksiyonunu hesaplamak için normcorr2 işlevini kullanın. Korelasyon fonksiyonunun en yüksek çapraz korelasyonuna sahip lineer indeksi algılamak için max fonksiyonunu kullanın ve ardından kayıtlı görüntünün hareket konumunu orijinal görüntüsünden hesaplamak için ind2sub fonksiyonunu kullanın. R-CaMP görüntüsünü adım 4.3.3.3’te hesaplanan konuma çevirmek için çarpıtma işlevini kullanın ve ardından R-CaMP’nin kayıtlı görüntüsünü kaydetmek için imwrite işlevini kullanın. Kalsiyum izlerinin oluşumuMATLAB kullanarak aşağıdaki işlemleri gerçekleştirin. Adım 4.3.3.4’te oluşturulan tüm kayıtlı R-CaMP tiff görüntülerini okumak için imread işlevini kullanın. Kayıtlı görüntüler çalışma alanına zaten değişken olarak yüklenmişse, bu adımı atlayın. Zaman projeksiyonu görüntüsü oluşturmak için ortalama işlevini kullanın. Ortalama görüntüyü şekil olarak göstermek için imshow işlevini kullanın; hedef yapının ikili ROI maskesini oluşturmak için roipoly işlevini kullanın (bu verilerdeki dendritik omurga). İkili maskenin giriş değişkenleri olarak her karenin görüntüleriyle çarpılmasıyla elde edilen görüntülerle ortalama işlevini kullanarak, her kare için YG içindeki ortalama floresan yoğunluğunu hesaplayın. Daha önce17’de açıklandığı gibi, adım 4.4.3’te elde edilen değişkene, yüksek frekanslı gürültüyü kesmek için kesme = 1.6 s’de tereyağı değeri frekans filtresini uygulayın ve ardından düşük frekanslı gürültüyü kesmek için zaman penceresinde = 200 s’de kayan medyan filtreyi uygulayın.