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Neuroscience

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Published: August 23, 2022
doi:
10.3791/64111
, , , ,
1Department of Cellular Neurobiology, Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine,The University of Tokyo

Summary

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Abstract

Da die Gehirnfunktionen unter dem ständigen Einfluss der Signale stehen, die aus peripheren Geweben stammen, ist es wichtig aufzuklären, wie Gliazellen im Gehirn verschiedene biologische Bedingungen in der Peripherie wahrnehmen und die Signale an Neuronen weiterleiten. Mikroglia, Immunzellen im Gehirn, sind an der synaptischen Entwicklung und Plastizität beteiligt. Daher sollte der Beitrag von Mikroglia zum Aufbau neuronaler Schaltkreise als Reaktion auf den inneren Zustand des Körpers durch intravitale Bildgebung des Zusammenhangs zwischen Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität kritisch überprüft werden.

In dieser Arbeit beschreiben wir eine Technik zur simultanen Abbildung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität in wachen Mäusen. Das Adeno-assoziierte Virus, das für R-CaMP kodiert, ein genkodierter Kalziumindikator für das rote Fluoreszenzprotein, wurde in die Schicht 2/3 des primären visuellen Kortex in CX3CR1-EGFP-transgene Mäuse injiziert, die EGFP in Mikroglia exprimieren. Nach der Virusinjektion wurde ein kraniales Fenster auf der Gehirnoberfläche der injizierten Region installiert. Die In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung an wachen Mäusen 4 Wochen nach der Operation zeigte, dass neuronale Aktivität und Mikrogliadynamik gleichzeitig mit einer zeitlichen Auflösung von weniger als einer Sekunde aufgezeichnet werden konnten. Diese Technik kann die Koordination zwischen der Dynamik der Mikroglia und der neuronalen Aktivität aufdecken, wobei erstere auf periphere immunologische Zustände und letztere auf die internen Gehirnzustände kodieren.

Introduction

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass der innere Zustand des Körpers die Gehirnfunktionen bei Tieren ständig beeinflusst 1,2,3,4,5. Um ein tieferes Verständnis der Gehirnfunktionen zu erlangen, ist es daher entscheidend aufzuklären, wie Gliazellen im Gehirn biologische Zustände in der Peripherie überwachen und die Informationen an Neuronen weiterleiten.

Mikroglia, Immunzellen im Gehirn, sind an der synaptischen Entwicklung und Plastizität beteiligt, die die Eigenschaften der neuronalen Schaltkreise im Gehirn formen 6,7,8,9. So konnte in der Pionierarbeit von Wake et al. gezeigt werden, dass Mikrogliafortsätze im Neokortex der Maus neuronal aktivitätsabhängig mit Synapsen in Kontakt treten und dass eine künstliche Ischämie nach längerem Kontakt mit Mikroglia einen Synapsenverlust induziert10. Tremblay et al. fanden heraus, dass eine Veränderung der visuellen Erfahrung die Modalität der Interaktion der Mikroglia mit Synapsen verändert. Während der kritischen Phase, in der der dendritische Dornenumsatz im primären visuellen Kortex (V1) durch binokularen Deprivation erhöht ist, verringert die Dunkeladaption die Motilität der Mikrogliafortsätze und erhöht sowohl ihre Kontaktfrequenz mit synaptischen Spalten als auch die Anzahl der zellulären Einschlüsse in Mikroglia11. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mikrogliaprozesse neuronale Aktivität und ihre Umgebung wahrnehmen, um neuronale Schaltkreise umzugestalten. Darüber hinaus berichtete eine kürzlich durchgeführte Studie, dass sich die Überwachung der Mikroglia zwischen wachen und anästhesierten Bedingungen unterscheidet, was auf die Bedeutung von Experimenten mit wachen Mäusen für die Untersuchung der Kommunikation zwischen Neuronen und Mikroglia unter physiologischen Bedingungen hindeutet12.

Die In-vivo-Zwei-Photonen-Kalziumbildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Aufzeichnung der Kalziumdynamik, die das laufende neuronale Feuern in Hunderten von Neuronen gleichzeitig in einem lebenden Tier widerspiegelt13,14,15. Die Kalzium-Bildgebung in Neuronen erfordert im Allgemeinen eine zeitliche Auflösung von mehr als einigen Hz, um schnelle neuronale Reaktionen zu verfolgen16,17. Im Gegensatz dazu haben frühere Studien, die die Dynamik der Mikroglia verfolgen, Mikrogliastrukturen mit einer relativ geringen zeitlichen Auflösung von weniger als 0,1 Hz abgetastet 18,19,20. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde die simultane Zwei-Photonen-Bildgebung angewendet, um die Kommunikation zwischen Neuronen und Mikroglia zu verstehen21. Es ist jedoch noch unklar, wie dynamische Mikrogliafortsätze in wachen Mäusen mit einer zeitlichen Auflösung von mehr als wenigen Hz auf die umgebende neuronale Aktivität reagieren. Um dieses Problem zu lösen, beschreiben wir eine simultane in vivo Zwei-Photonen-Bildgebungsmethode der neuronalen Aktivität und Mikrogliadynamik mit einer zeitlichen Auflösung von mehr als 1 Hz in wachen Mäusen. Diese Methode ermöglicht es uns, eine stabile Bildgebung in wachen Mäusen bei einer höheren Bildrate (maximal 30 Hz bei einer Pixelbildgröße von 512 x 512 Pixeln) zu erreichen und bietet eine günstigere Möglichkeit, das Überwachungsverhalten von Mikroglia oder ihre Interaktion mit der neuronalen Aktivität in wachen Mäusen zu untersuchen.

Protocol

Alle Experimente wurden von der Tierethikkommission und dem Sicherheitsausschuss für genetische Rekombinantenexperimente der Graduate School of Medicine und der Medizinischen Fakultät der Universität Tokio genehmigt und gemäß deren Richtlinien durchgeführt. 1. Vorbereitung Sterilisieren Sie alle für die Operation erforderlichen Instrumente und Apparate mit Autoklav oder 70%igem Ethanol. Vorbereitung der Glaspipette.Befestigen Sie eine kalibrierte 75-μl-Kapillare fest an der Halterung des Mikropipettenziehers. Stellen Sie den Abzieher auf das Programm mit den empfohlenen Parametern wie P (Druck) = 500, HEAT = 680, PULL = 30, VEL = 60, TIME = 180 ein. Nach Beendigung des Programms (in der Regel 4,5 bis 5 s) wird die Kapillare in zwei Glaspipetten mit sich verjüngenden Enden geteilt. Brechen Sie dann den distalen Teil der Schwänze mit einer Pinzette auf, um den Spitzendurchmesser innerhalb von 30-50 μm zu halten. Brechen Sie dazu die Schwänze 1 cm distal zum Ende des abgeschrägten Teils. Für die Kraniotomie bereiten Sie ein Schädelfenster vor, indem Sie eine größere äußere Glasscheibe mit einem Durchmesser von 4 mm und einer Dicke von 0,15 ± 0,02 mm mit einem UV-Lichthärtereagenz auf eine kleinere innere Glasscheibe mit einem Durchmesser von 2 mm und einer Dicke von 0,525 ± 0,075 mm kleben (Abbildung 2A). 2. AAV-Injektion Vorbereitung der InjektionsapparaturSetzen Sie eine Glaspipette, die mit einer 26-G-Hamilton-Spritze durch einen Schlauch verbunden ist, auf einen Pipettenhalter eines stereotaktischen Instruments und kippen Sie dann den Pipettenhalter um 60° nach vorne von der vertikalen Achse (Abbildung 1A, B). Füllen Sie die Glaspipette, die Spritze und das Verbindungsröhrchen mit flüssigem Paraffin. Legen Sie die Spritze auf einen Mikroinjektor. Chirurgischer EingriffHINWEIS: Die folgende Operation wurde in einer sterilisierten Kabine durchgeführt. Bei Bedarf wurde für die Operation ein Stereomikroskop verwendet.Anästhesieren Sie eine männliche CX3CR1-EGFP-Maus (detaillierte Informationen in der Materialtabelle) im Alter von 7 bis 8 Wochen (Körpergewicht 22-26 g) mit 3 % Isofluran in einer gasdichten Kammer. Nehmen Sie die Maus nach 3 Minuten aus der Kammer, wenn sie außer der Atmung keine willkürliche Bewegung mehr hat, und schalten Sie dann auf eine Daueranästhesie mit einer Nasensonde mit 2 % Isofluran um.HINWEIS: Es ist bekannt, dass Isofluran Mikroglia aktiviert. Da die Bildgebung jedoch 4 Wochen nach der Operation durchgeführt wird, gibt es während der Bildgebung keine Wirkung von Isofluran auf die Mäuse. Obwohl eine Isofluran-Anästhesie für einige Minuten verwendet wird, wenn Mäuse vor der Bildgebung in das stereotaktische Instrument gelegt werden (Schritt 4.2.1), stellten wir fest, dass die Wirkung dieser kurzen Anästhesie vernachlässigbar ist. Halten Sie die Maus während der Operation mit einem Heizkissen bei 37 °C warm, um eine Unterkühlung zu vermeiden. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Hornhauttrockenheit vorzubeugen, und verabreichen Sie eine Meloxicam-Injektion subkutan (5 mg/kg). Befestigen Sie die Maus an einer zusätzlichen Ohrbügel und befestigen Sie die Maus dann mit der dorsalen Seite nach oben am stereotaktischen Instrument. Stellen Sie die Isoflurankonzentration während der Operation auf einen geeigneten Prozentsatz (1%-2%) ein, während Sie die Atem- und Herzfrequenz überwachen. Entfernen Sie die Haare mit Enthaarungscreme und desinfizieren Sie den Kopf mehrmals in kreisenden Bewegungen sowohl mit einem Peeling auf Jod- oder Chlorhexidinbasis als auch mit Alkohol. Injizieren Sie dann 0,1 ml 1%iges Lidocain subkutan und legen Sie sterile Abdeckungen an, um die Operationsstelle zu sichern. Schneiden Sie die Kopfhaut entlang der Mittellinie mit einer Schere auf und machen Sie den Schnitt etwa 2 cm lang, um eine gute Freilegung des Schädels über der rechten primären Sehrinde zu gewährleisten. Spülen Sie nach dem Einschnitt der Kopfhaut den Kopf während des gesamten Eingriffs mit Kochsalzlösung, um zu verhindern, dass der freiliegende Schädel und das Gehirn austrocknen. Entfernen Sie die Knochenhaut am freiliegenden Schädel mit einer Pinzette. Bohren Sie den Schädel auf die stereotaktischen Koordinaten: 3 mm lateral zur Mittellinie, 0,5 mm vor der Lambda-Linie, um ein kleines Loch mit ca. 0,5 mm Durchmesser zu erzeugen. Spülen Sie bei Bedarf Blut und Gewebereste vom Bohrer ab. Füllen Sie die Glaspipette mit 1 μL rAAV2/1-hSyn-R-CaMP1.07 mit folgendem Verfahren bei einem Titer von 8,3 x 1012 Vektorgenomen/ml22.Schieben Sie die Spritze vor, um 1 μl flüssiges Paraffin aus der Glaspipette auszustoßen. Legen Sie ein Stück transparenter Folie von ca. 2 cm x 2 cm auf den freiliegenden Schädel der Maus und stoßen Sie mit einer Pipette einen Tropfen von 1 μl AAV-Lösung auf den Film aus. Setzen Sie die Glaspipettenspitze in den Tropfen der AAV-Lösung auf der Folie ein und ziehen Sie vorsichtig an der Spritze, um die AAV-Lösung anzusaugen. Drehen Sie nach dem Auswurf den T-förmigen Absperrhahn, um den Druck im Inneren des Röhrchens und der Glaspipette abzulassen. Führen Sie die Glaspipette bis zu einer Tiefe von 500 μm von der Gehirnoberfläche durch das in Schritt 2.2.5 erzeugte Loch ein und injizieren Sie dann 0,5 μl AAV-Lösung mit dem Mikroinjektor (Abbildung 1C). Verwenden Sie den Injektionsvolumenstrom von 2,0 μL/h; Eine Injektion von 0,5 μl dauert 15 Minuten und wartet anschließend 5 Minuten. Ziehen Sie nach der Injektion vorsichtig die Glaspipette heraus und spülen Sie die Gehirnoberfläche mit Kochsalzlösung ab. 3. Implantation des Schädelfensters HINWEIS: Die Implantation des Schädelfensters folgt auf die AAV-Injektion am selben Tag. Markieren Sie einen Kreis mit einem Durchmesser von 2,5 mm auf dem Schädel, der 3 mm seitlich vom Lambda zentriert ist. Erzeugen Sie durch Bohren eine kreisförmige Nut entlang der Markierung auf dem Schädel. Reinigen Sie den Schmutz, da er die Sicht des Schädels beeinträchtigen kann, und tragen Sie während des Bohrvorgangs Kochsalzlösung auf, um eine Erwärmung zu verhindern. Um zu prüfen, ob die Bohrtiefe in der Kreisnut ausreicht, um das zentrale Schädelfragment zu entfernen, drücken Sie vorsichtig mit einer Pinzette auf den zentralen Schädel. Bewegt er sich mit geringem Widerstand senkrecht, ist die Bohrtiefe ausreichend. Wenn die Rille eine ausreichende Tiefe erreicht hat, führen Sie die Spitze der Pinzette in die Unterseite des zentralen Schädelfragments ein und heben Sie sie vorsichtig an und entfernen Sie sie, um die Gehirnoberfläche freizulegen (Abbildung 1D). Mit einer 27-G-Nadel die Dura am Rand der freiliegenden Gehirnoberfläche einstechen und zerreißen. Führen Sie die Spitze der Pinzette durch das Loch am Rand der Dura ein. Halten Sie die Dura fest und ziehen Sie sie ab, um die Gehirnoberfläche freizulegen.Anmerkungen: Wenn Blutungen auftreten, spülen Sie die Gehirnoberfläche mit Kochsalzlösung ab, bis die Blutung aufhört. Dispergieren Sie die hämostatischen Fasern mit einer Pinzette nacheinander in Kochsalzlösung in einer 3,5-mm-Schale und platzieren Sie dann die hämostatischen Fasern entlang der Ränder des Lochs, in dem sich die durchtrennte Dura befindet. Platzieren Sie ein in Schritt 1.3 vorbereitetes Schädelfenster auf der freiliegenden Gehirnoberfläche und kleben Sie es dann mit Sekundenkleber auf den Schädel, während Sie vorsichtig auf das Fenster drücken, so dass das Fenster in engem Kontakt mit dem Schädel steht. Tragen Sie anschließend Sofortkleber auf den gesamten freiliegenden Schädel auf und befestigen Sie dann vorsichtig eine Kopfplatte am Schädel, so dass sich das Fenster in der Mitte des quadratischen Lochs der Kopfplatte befindet (Abbildung 2C). Achten Sie darauf, dass die Oberfläche der Kopfplatte parallel zur Oberfläche des Glasfensters verläuft. Nachdem der Kleber ausreichend ausgehärtet ist, tragen Sie Zahnzement auf den freiliegenden Schädel auf, um die Befestigung zwischen Kopf und Kopfplatte zu verstärken (Abbildung 2).HINWEIS: Wenn die Experimente die Präsentation visueller Reize für Mäuse beinhalten, sollte Streulicht in den Bildgebungsbereich vermieden werden. Es ist ratsam, den Zement zu schwärzen, indem man ihn mit der Aktivkohle mischt, um die Lichtreflexion zu reduzieren. Nehmen Sie die Maus aus der Narkose, nachdem der Zement ausreichend ausgehärtet ist (ca. 20 min). Setzen Sie die Maus dann in einen neuen Käfig, um sich alleine zu erholen. Nachdem Sie ihr Bewusstsein und ihre willkürliche Bewegung bestätigt haben, was auf eine vollständige Genesung hinweist, setzen Sie die Maus wieder in den häuslichen Käfig. Verabreichen Sie während der Genesung eine zweite oder bei Bedarf mehrere, Meloxicam-Dosis (einmal alle 24 Stunden für 1-3 Tage), wenn offensichtliche schmerzanzeigende Verhaltensweisen auftreten. 4. In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung von Mikroglia und neuronaler Kalziumdynamik Gewöhnung von Mäusen an den MikroskopapparatDrei Wochen nach der Operation wird die Maus mit 3 % Isofluran betäubt und die Maus mit einem speziell angefertigten stereotaktischen Instrument unter die 25-fach-Objektivlinse eines Zwei-Photonen-Mikroskops gestellt (Abbildung 3C). Für die Einrichtung wird hier die Maus auf die Oberseite eines Laufbandes gestellt und darf frei laufen. Nehmen Sie die Maus etwa 10 Minuten später aus dem Mikroskoptisch und stellen Sie sie wieder in den Heimkäfig. Wiederholen Sie die Gewöhnung mindestens 3 Mal jeden zweiten Tag vor der Zwei-Photonen-Bildaufnahme. Zwei-Photonen-BildaufnahmeHINWEIS: Wir empfehlen, die Bildaufnahme mehr als 4 Wochen nach der Operation durchzuführen, da die Mikrogliaaktivierung allmählich auf die Basalebene zurückkehrt.Wie in Schritt 4.1 induzieren Sie die Anästhesie in der Maus mit 3%igem Isofluran und legen Sie die Maus mit einem speziell angefertigten stereotaktischen Instrument unter die Objektivlinse des Zwei-Photonen-Mikroskops. Installieren Sie die speziell angefertigte Beschattungsvorrichtung und einen LCD-Monitor zur visuellen Stimulation wie unten beschrieben (Abbildung 3D).Positionieren Sie das Objektiv so, dass es auf die Gehirnoberfläche fokussiert, und legen Sie dann diese Linsenposition als ursprüngliche Z-Position fest. Halten Sie die x-y-Koordinaten konstant und heben Sie die Objektivlinse an. Entfernen Sie die Maus und das stereotaktische Instrument von der Objektivlinse und dem Laufband. Befestigen Sie eine Beschattungsvorrichtung auf der Oberseite der Kopfplatte mit Silikon, das durch Mischen mit Holzkohlepulver geschwärzt wird, und stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen der Kopfplatte und der Beschattungsvorrichtung gut abgedichtet ist. Füllen Sie das Beschattungsgerät mit destilliertem Wasser und befestigen Sie dann die Maus und den stereotaktischen Rahmen wieder unter dem Objektiv und auf dem Laufband. Setzen Sie die Fokusebene an der Gehirnoberfläche vorsichtig zurück und überprüfen Sie die Tiefe der Objektivlinse.Anmerkungen: Um das Risiko einer Beschädigung der Objektivlinse zu vermeiden, stellen Sie zuerst die xyz-Koordinaten ein und wenden Sie dann die Abtastvorrichtung der Objektivlinse an. Es ist auch sinnvoll, zuerst die Abdeckung zu installieren und dann die Koordinaten anzupassen, aber für diese Option ist eine vorsichtige Handhabung erforderlich. Decken Sie die Objektivlinse mit schwarzer Aluminiumfolie ab, um eine Lichtverschmutzung durch den LCD-Monitor zu vermeiden, der für die visuelle Stimulation durch die Objektivlinse verwendet wird (Abbildung 3D). Stellen Sie einen 10-Zoll-LCD-Monitor 12,5 cm vor die Augen der Maus auf, um visuelle Reize darzustellen (Abbildung 3D). Konfigurieren Sie die Fluoreszenzemissionssammelfilter auf EGFP-Fluoreszenz (525/50 nm Emissionsfilter) und R-CaMP-Fluoreszenz (593/46 nm Emissionsfilter) und die Anregungswellenlänge auf 1.000 nm. Erfassen Sie Bilder mit einer räumlichen Auflösung von 0,25 μm/Pixel mit einem 25x 1,1 NA-Objektiv und GaAsP-PMTs. Finden Sie die Bildregion, in der R-CaMP(+)-Neuronen und EGFP(+)-Mikroglia gleichzeitig in Schicht 2/3 abgebildet werden können. Für diesen Aufbau wurden die in Abbildung 4 und Video 1 erfassten Daten in einer Tiefe von 100 μm von der Pialoberfläche unter Verwendung einer Live-Bildvorschau erfasst. Halten Sie die Leistung des Anregungslasers so gering wie möglich, um ein Ausbleichen und Schäden durch erhöhte lokale Temperaturen im Bildbereich zu vermeiden. Erfassen Sie Bilder mit einer Bildrate von 30 Hz. Gleichzeitig mit der Bildaufnahme präsentieren Sie der Maus17 einen drifting-grating visuellen Reiz bei 100% Kontrast, 1,5 Hz, 0,04 Zyklen pro Grad in 12 Richtungen bei 6 Orientierungen von 0° bis 150° in 30°-Schritten. Nehmen Sie nach der Bildaufnahme die Maus vom Mikroskoptisch, trennen Sie die Beschattungsvorrichtung und das stereotaktische Instrument von der Maus und bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück. DatenregistrierungKonvertieren und speichern Sie die erfassten Bilddaten (in diesem Fall das nd2-Format) als eine Reihe von TIFF-Bilddateien für jeden Farbkanal mit Fidschi oder der mit dem Mikroskop gelieferten Software. Wenden Sie Turboreg, ein Plugin von Fidschi, an, um die Registrierung mit mode = translation durchzuführen. Verwenden Sie das gemittelte Bild als Referenzbild mit den TIFF-Bilddateien des EGFP-Kanals. Führen Sie die folgende Verarbeitung für jeden Frame mit MATLAB durch.HINWEIS: Obwohl MATLAB in der folgenden Verarbeitung verwendet wird, konzentriert sich die Beschreibung hauptsächlich auf die Absicht jedes Schritts, damit Daten von anderer Programmiersoftware wie Python analysiert werden können.Verwenden Sie die imread-Funktion, um zwei EGFP-TIFF-Bilder vor bzw. nach der Registrierung desselben Frames zu lesen. Verwenden Sie die imread-Funktion, um das R-CaMP-TIFF-Bild desselben Frames zu lesen. Verwenden Sie die Funktion normcorr2, um die Korrelationsfunktion zwischen den vektorisierten Variablen der beiden GFP-Bilder zu berechnen, die in Schritt 4.3.3.1 gelesen wurden. Verwenden Sie die max-Funktion, um den linearen Index mit der höchsten Kreuzkorrelation der Korrelationsfunktion zu ermitteln, und verwenden Sie dann die ind2sub-Funktion, um die Bewegungsposition des registrierten Bildes aus dem Originalbild zu berechnen. Verwenden Sie die Imwarp-Funktion, um das R-CaMP-Bild in die in Schritt 4.3.3.3 berechnete Position zu übersetzen, und verwenden Sie dann die Imwrite-Funktion, um das registrierte Bild von R-CaMP zu speichern. Erzeugung von CalciumspurenFühren Sie die folgende Verarbeitung mit MATLAB durch. Verwenden Sie die imread-Funktion, um alle registrierten R-CaMP-TIFF-Bilder zu lesen, die in Schritt 4.3.3.4 generiert wurden. Wenn die registrierten Bilder bereits als Variable in den Arbeitsbereich geladen wurden, überspringen Sie diesen Schritt. Verwenden Sie die Mittelwertfunktion, um ein Zeitprojektionsbild zu erzeugen. Verwenden Sie die imshow-Funktion, um das gemittelte Bild als Zahl anzuzeigen. Verwenden Sie die ROIPOLY-Funktion, um eine binäre ROI-Maske der Zielstruktur (dendritische Wirbelsäule in diesen Daten) zu generieren. Berechnen Sie unter Verwendung der Mittelwertfunktion mit den Bildern, die durch Multiplikation der binären Maske mit Bildern jedes Frames als Eingangsvariablen erhalten werden, die gemittelte Fluoreszenzintensität innerhalb des ROI für jedes Frame. Wie zuvor17 beschrieben, wenden Sie auf die in Schritt 4.4.3 erhaltene Variable den Butterwert-Frequenzfilter bei Cutoff = 1,6 s an, um hochfrequentes Rauschen zu schneiden, und wenden Sie dann den gleitenden Medianfilter im Zeitfenster = 200 s an, um niederfrequentes Rauschen zu schneiden.

Representative Results

Wir führten die AAV-Injektion und die Schädelfensterimplantation in V1 einer 8 Wochen alten CX3XR1-EGFP-transgenen Maus durch, wie in diesem Protokoll beschrieben. Vier Wochen nach der Operation führten wir eine simultane in vivo Zwei-Photonen-Bildgebung der R-CaMP-basierten neuronalen Aktivität und Mikrogliadynamik in Schicht 2/3 von V1 durch (Abbildung 4 und Video 1). Während der Bildgebung wurde die Maus auf ein Laufband gelegt und durfte frei laufen. Die Bilder wurden mit einer Bildrate von 30 Hz mit einer räumlichen Auflösung von 0,25 μm/Pixel unter Verwendung eines 25x, 1,1 NA-Objektivs und GaAsP-PMTs aufgenommen. Sowohl EGFP als auch R-CaMP wurden bei einer Wellenlänge von 1.000 nm angeregt, und EGFP-Fluoreszenz (525/50 nm Emissionsfilter) und R-CaMP-Fluoreszenz (593/46 nm Emissionsfilter) wurden gleichzeitig gesammelt. Nach der Registrierung der erfassten Daten zur Minimierung von Bewegungsartefakten wurden alle vier Bilder zu einem Bild gemittelt, um Hintergrundgeräusche zu reduzieren. Der Maus wurden knirschende visuelle Reize präsentiert und die visuellen Reaktionen von Neuronen und einzelnen dendritischen Dornen analysiert (Abbildung 4D). Die Fortsätze der Mikroglia zeigten eine schnelle Dynamik und änderten ihre Morphologie innerhalb von 10 s (Abbildung 4E und Video 1). Wie im Abschnitt “Diskussion” beschrieben, konnte die Expression von R-CaMP nicht nachgewiesen werden, wenn die AAV-Injektion fehlschlug. War die Operation nicht erfolgreich, konnten die Signale von EGFP und R-CaMP nicht beobachtet werden. Abbildung 1: AAV-Injektion . (A) Eine Glaspipette wurde mit einem Silikonröhrchen an eine 26-G-Hamilton-Spritze angeschlossen. (B) Der Aufbau für die AAV-Injektion. (C) Die AAV-Lösung wurde über die um 60° von der vertikalen Achse geneigte Glaspipette injiziert. (D) Schematische Darstellung des Verfahrens des offenen Schädels (beschrieben in Schritt 3.3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Schädelfenster und Kopfplatte . (A) Schematische Darstellung der Schädelfensterimplantation. (B) Es wurden maßgefertigte Kopfplatten verwendet. Für die Bildgebung in der rechten Hemisphäre sollte der kürzere Arm auf der rechten Seite verwendet werden. (C) Dorsale Ansicht einer Maus mit einem Schädelfenster und einer implantierten Kopfplatte. (D) Ansicht des in Abbildung 2C gezeigten Schädelfensters mit hoher Vergrößerung. (E) Dorsale Ansicht einer Maus, die mit dem speziell angefertigten stereotaktischen Instrument fixiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Der Aufbau für die In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung. (A) Dorsale Ansicht der Beschattungsvorrichtung. (B) Seitenansicht der Beschattungsvorrichtung. (C) Ansicht einer Maus mit der Beschattungsvorrichtung auf der Kopfplatte unter der Objektivlinse. Die Maus wird auf das Laufband gelegt. (D) Blick unter das Zwei-Photonen-Anregungsmikroskop. Auf der rechten Seite der Figur befindet sich ein Monitor, der visuelle Reize präsentiert. Die Objektivlinse ist mit der Beschattungsvorrichtung und schwarzer Aluminiumfolie abgedeckt, um zu verhindern, dass Licht vom Monitor auf die Objektivlinse gelangt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Mikrogliadynamik und visuelle Reaktionen in einer dendritischen Wirbelsäule. (A-C) Zeitgemittelte Bilder von EGFP(+)-Mikroglia- und R-CaMP(+)-Neuronen in Schicht 2/3 von V1 in einer 12 Wochen alten CX3XR1-EGFP-transgenen Maus. Die Signalintensität in jedem Kanal wurde unabhängig voneinander normalisiert. (D) Visuelle Reaktionen in einer dendritischen Wirbelsäule. Streifendiagramme mit schwarzen Pfeilen zeigen die Richtung der Gitterreize an, die in dem durch graue Säulen angezeigten Timing dargestellt werden. In Kalziumspuren zeigen graue Linien individuelle Reaktionen und eine schwarze Linie ihren Durchschnitt an. Im rechten Ausschnitt zeigt eine gelbe Pfeilspitze den dendritischen Rücken an, in dem die Region of Interest (ROI) erzeugt wurde, um die Kalziumspuren zu erfassen. (E) Der Fortsatz der Mikroglia (cyanfarbene Pfeilspitze) zeigte eine schnelle Retraktion innerhalb von 10 s. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Video 1: Zwei-Photonen-Bildgebung der neuronalen Aktivität und Mikrogliadynamik. Bildgebungsdaten von EGFP(+)-Mikroglia und R-CaMP(+)-Neuronen in Schicht 2/3 von V1 in einer 12 Wochen alten CX3XR1-EGFP-transgenen Maus. Auf der linken Seite des Films steht Magenta für R-CaMP in Neuronen und Grün für EGFP in Mikroglia. Die Mitte des Films entspricht dem EGFP-Signal und die rechte Seite dem R-CaMP-Signal. Die Signalintensität in jedem Kanal wurde unabhängig voneinander normalisiert. Die Bildrate des Films ist 40-mal schneller als die tatsächliche Rate. Maßstabsbalken = 10 μm Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Discussion

Wir beschreiben das Protokoll der AAV-Injektion und Kraniotomie zur simultanen Bildgebung der Mikrogliadynamik und neuronalen Aktivität in wachen Mäusen sowie die Datenverarbeitung. Diese Technik kann die Koordination zwischen Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität auf Zeitskalen von unter einer Sekunde bis zu Dutzenden von Sekunden aufdecken.

Das Operationsprotokoll umfasst mehrere technisch anspruchsvolle Schritte. Die AAV-Injektion ist einer der entscheidenden Schritte. Eine erfolglose AAV-Injektion kann zu einer signifikanten Verringerung der Expression von R-CaMP führen. Dafür gibt es zwei Hauptgründe: verstopfte Glaspipetten und Gewebeschäden. Das Verstopfen von Glaspipetten reduziert oder blockiert den Ausstoß der AAV-Lösung vollständig. Diese Situation kann vermieden werden, indem die AAV-Lösung mit einem Farbstoff wie Fast Green eingefärbt und der Erfolg der Injektion visuell bestätigt wird. Gewebeschäden, die durch die AAV-Injektion verursacht werden, verhindern die exogene Genexpression in der Nähe des Zentrums der Injektionsstelle. Die durch die AAV-Injektion induzierte Schädigung wird wahrscheinlich durch einen plötzlichen Anstieg des Ausflusses aus der Spitze der Glaspipette nach dem Aufbau des Drucks in der Pipette verursacht. Daher sollte der Ausfluss der AAV-Lösung aus der Glaspipette während der Injektion konstant sein. Die Wahl von Glaspipetten mit einem etwas größeren Durchmesser an den Spitzen würde dieses Problem lösen. Bei der Implantation von kranialen Fenstern ist die Geschwindigkeit der Operation entscheidend. Dauert die Operation zu lange, kann das Hirngewebe stark geschädigt werden. Dementsprechend ist wiederholtes Üben notwendig, um die Geschwindigkeit und den reibungslosen Ablauf der Operation zu gewährleisten. Darüber hinaus kann die Qualität der Bildgebung während der 4 Wochen von der Operation bis zur Bildgebung durch die Geweberegeneration zwischen dem Schädelfenster und dem Hirngewebe durch die herkömmliche Methode verringert werden17. Die Methode überwindet dieses Problem, indem sie dicke Gläser für die innere Glasscheibe der Schädelfenster aufbringt, um die Geweberegeneration zu hemmen und das Fenster frei zu halten. Bei dem hier beschriebenen System zeigte sich dieser Effekt durch die Verwendung einer inneren Glasscheibe mit einer Dicke von 0,525 ± 0,075 μm.

Die Methode kann erfolgreich auf Mäuse angewendet werden, die älter als 4 Wochen sind, aber die Anwendung auf jüngere Mäuse kann problematisch sein. Bei juvenilen Mäusen zeigt der Schädel ein schnelles und auffälliges Wachstum, was zu einer Diskrepanz zwischen dem Schädelknochen und dem Glasfenster führt.

In einigen hochmodernen Studien wurde die In-vivo-Zwei-Photonen-Bildgebung verwendet, um die Interaktionen zwischen Mikroglia und Neuronen zu untersuchen 12,21,23. Insbesondere in der Pionierarbeit von Merlini et al. führten sie simultane In-vivo-Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität innerhalb der Zellkörper durch21. Mit dieser Methode konnten wir durch die Verwendung dickerer Innengläser für Schädelfenster Bewegungsartefakte in der Tiefenorientierung unterdrücken und die stabile Messung der neuronalen Aktivität in Mikrostrukturen, wie z.B. dendritischen Dornen, erreichen. Diese Methode würde helfen, die Interaktionen zwischen Synapsen und Mikroglia in wachen Mäusen zu untersuchen.

Kürzlich wurde in einer In-vitro-Studie gezeigt, dass dünne filopodienähnliche Mikrogliafortsätze eine schnellere Motilität aufweisen als dicke Fortsätze, was auf die Bedeutung ihrer schnelleren Motilität bei der Überwachung hindeutet19. Das System kann hier die Motilität dünner Mikrogliafortsätze mit einer zeitlichen Auflösung von einer Subsekunde bis zu einigen Dutzend Sekunden verfolgen. Diese Eigenschaft trägt dazu bei, die funktionelle Bedeutung ihrer Motilität für die Überwachung in vivo aufzuklären.

In Zukunft würde die Kombination dieser bildgebenden Technik mit Interventionen wie der Optogenetik24 oder der Chemogenetik25, die auf lokale neuronale Schaltkreise oder interregionale neuronale Verbindungen angewendet werden, Aufschluss über neue Mikrogliafunktionen in der synaptischen Entwicklung und Plastizität geben, die Eigenschaften neuronaler Schaltkreise formen. Auch die weitere Integration von Bildgebungs-, Interventions- und Verhaltensaufgaben würde dazu beitragen, die Koordination von Mikroglia und Neuronen aufzudecken, die bestimmten Verhaltensweisen zugrunde liegen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Masashi Kondo und Dr. Masanori Matsuzaki für die Bereitstellung von Virusvektoren. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 an S.O.), die Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 und JP17gm5010003 an S.O. und JP19dm0207082 an H.M.), das UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), die Japan Science and Technology Agency Moonshot R&D (JPMJMS2024 to H.M.), Stiftung für Hirnforschung (an H. M.).

Materials

10-inch LCD monitor EIZO DuraVision FDX1003 For presenting grating visual stimuli
26G Hamilton syringe Hamilton 701N
27G needle Terumo NN-2719S
AAV-hSyn-R-CAMP1.07 N/A N/A Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory 
Activated charcoal powder Nacalai tesque 07909-65
Black aluminum foil THORLABS BKF12
CX3CR1-EGFP mouse Jackson laboratory IMSR_JAX: 005582 CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus.
DENT SILICONE-V Shofu Inc N/A For the attachment of a shading device to a head-plate
Dental cement (quick resin, liquid) Shofu Inc N/A AB
Dental cement(quick resin, powder) Shofu Inc N/A B Color 3
Drill Toyo Associates HP-200
Glass capillary pipette Drummond Scientific Company 2-000-075
Glass disc (large) Matsunami N/A 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness
Glass disc (small) Matsunami N/A 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness
Head-plate Customized N/A Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape
Hemostatic fiber Davol Inc 1010090
ImageJ Fiji software Free software For data registration
Instant glue (Aron alpha) Daiichi Sankyo N/A
Isoflurane Pfizer N/A
Lidocaine Astrazeneca N/A
MATLAB 2017b MathWorks N/A For data registration and processing
Meloxicam Tokyo Chemical Industry M1959
Microinjector KD scienfitic KDS-100
Micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
Multi-photon excitation microscope NIKON N/A The commercial name is "A1MP+".
Objective lens NIKON N/A The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W".
Paraffin Liquid Nacalai tesque 26132-35
Psychtoolbox Free software For presenting grating visual stimuli
Shading device Customized N/A
Stereomicroscope Leica M165 FC
Stereotaxic instrument Narishige Scientific Instrument SR-611 For the surgery
Stereotaxic instrument Customized N/A For fixing mice under the two-photon microscope
Stopcock ISIS VXB1079
Surgical silk Ethicon K881H
Treadmill Customized N/A
UV light curing agent Norland Products Inc NOA 65
Vaporizer Penlon Sigma Delta Anesthetic machine
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References

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Maruoka, H., Kamei, R., Mizutani, S., Liu, Q., Okabe, S. Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice. J. Vis. Exp. (186), e64111, doi:10.3791/64111 (2022).
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