יצירת תרביות ממשק אוויר-נוזל של תאי אפיתל דרכי הנשימה מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

כל אחד מהשלבים הבאים צריך להתבצע בטכניקה סטרילית במכסה זרימה למינרי ברמה של בטיחות ביולוגית 2. יש לחמם את כל המדיה לטמפרטורת החדר (22 מעלות צלזיוס) לפני הוספתה לתאים, למעט כאשר צוין במפורש אחרת. כל שלב צנטריפוגה צריך להתבצע בטמפרטורת החדר (בערך 22 מעלות צלזיוס). איור 1 מתאר את השרטוטים של הפרוטוקול. 1. הכנת המדיה הנדרשת הערה: ראה קובץ משלים 1 לקבלת פרטים. מדיום תא בסיס הכן את מדיום הבסיס על פי הוראות היצרן. לכל 50 מ”ל של מדיום הבסיס, הוסיפו 5 μL של A83-01 (10 mM), 5 μL של DMH1 (10 mM), 50 μL של Y-27632 (10mM) ו-100 μL של פרימוצין (50 מ”ג/מ”ל). להלן, מדיה זו מכונה מדיום תא בסיס. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד. מדיום הבחנה עלי הכן את המדיום על פי הוראות היצרן. לכל 50 מ”ל של מדיום התמיינות ALI, יש להוסיף 100 μL של פרימוצין (50 מ”ג/מ”ל). אחסן מוגן מפני אור בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) למשך עד חודש אחד. מאגר מיון עבור כל 50 מ”ל של מאגר מיון, שלבו 47.5 מ”ל של תמיסת המלח המאוזנת של הנקס, 1 מ”ל של FBS, 200 μL של EDTA (500 mM), 1.25 מ”ל של חיץ HEPES (1 M), 50 μL של Y-27632 (10 mM) ו-100 μL של פרימוצין (50 מ”ג/מ”ל). מסנן לעקר באמצעות גודל נקבובית של 0.4 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד. מדיום שימור בהקפאה עבור כל 50 מ”ל של מדיום שימור בהקפאה, שלבו 45 מ”ל של מדיום תאי בסיס ו-5 מ”ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO). מסנן לעקר באמצעות גודל נקבובית של 0.4 מיקרומטר. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד. 2. הפשרה של iBC בהקפאה הפשרה (על קרח) נפח מספיק של גורם גדילה תלת-ממדי הפחית את המטריצה החוץ-תאית (להלן מטריצה תלת-ממדית). יש לשמור על קרח עד שהם מוכנים לשימוש.הערה: בעת הפשרה של בקבוקון אחד (המכיל 250,000 תאים), הפשרה של 100-200 μL של מטריצה תלת-ממדית. להפשיר בקבוקון של תרחיפים חד-תאיים של תאי iBC שהושרו בעבר בהקפאה על ידי דגירה באמבט מים או חרוזים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס רק עד שאין מדיה קפואה נראית לעין (1-2 דקות). באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ”ל, מוסיפים את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מ”ל. הוסיפו 6-10 מ”ל של DMEM/F12 באופן טיפתי לתרחיף התא, ערבבו בעדינות וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות כדי להעיף את התאים. לשאוף את הסופרנטאנט ולהחיות את גלולת התא ב-1 מ”ל של מדיום תאי הבסיס עם מיקרופיפט P1000. יש להסיר 10 μL aliquot ולבצע ספירת תאים. צנטריפוגה של התאים ב 300 x g במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט ובצעו החייאה בתאים בצפיפות של 4,000 תאים/μL במטריצה תלת-ממדית שהופשרה בעבר עם מיקרופיפט P1000.הערה: חשוב להימנע מהוספת בועות למטריצה תלת-ממדית. פיפטה את המטריצה לאט ובזהירות. עם מיקרופיפט P200, הוסיפו טיפה אחת (25 או 50 μL) לבסיס של כל באר של צלחת שטופלה בתרבית רקמה של 12 בארות. אם מתחילים עם 250,000 תאים קפואים, המספר הצפוי של טיפות בשלב זה הוא בין 3-4 (25 μL טיפות), בהתאם לכדאיות התא. דגירו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-15 דקות, ולאחר מכן הוסיפו מספיק מדיום תא בסיסי לכל באר כדי להטביע את הטיפה במלואה (1.5 מ”ל עבור 50 μL; 1 מ”ל עבור 25 μL), באמצעות פיפטה סרולוגית של 5 מ”ל. מחזירים את הצלחת לחממה לחה. הזנת תאים כל יומיים באמצעות מדיום תאי בסיס טריים. מוסיפים מדיום טרי לצד הבאר עם פיפטה סרולוגית של 5 מ”ל, תוך הקפדה שלא להפריע לטיפות התאים.הערה: צפיפות התאים המצופים בשלב זה גבוהה פי 10 מההעברה השגרתית של תאי iBC בחלק 3. 3. דיסוציאציה של ספרואידים והרחבת iBC בתרבית תלת-ממדית להפשיר (על הקרח) נפח מספיק של מטריצה תלת-ממדית. יש לשמור על קרח עד שהם מוכנים לשימוש.הערה: נפח המטריצה התלת-ממדית הנדרשת ישתנה בהתאם למספר התאים שהמשתמש יזדקק להם. כ-5-7 ימים לאחר מכן, שאפו את המדיום מכל באר ועם מיקרופיפט P1000, הוסיפו 1 מ”ל של Dispase II (1 U/mL) ישירות על הספרואידים כדי להתנתק מהטיפה של המטריצה. הניחו את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. באמצעות מיקרופיפט P1000, פיפט את הדיספאז למעלה ולמטה 1-2 פעמים, תוך שבירת גושים גדולים של מטריצה תלת-ממדית. מחזירים את הצלחת ל-37 מעלות צלזיוס למשך 30-40 דקות נוספות, ומאפשרים למטריצה להתמוסס לחלוטין. כאשר טיפת המטריצה התלת-ממדית אינה נראית עוד מתחת למיקרוסקופ האור, הוסיפו את הספרואידים הצפים בחופשיות לחרוט של 15 מ”ל באמצעות קצה פיפטה סרולוגי של 5 מ”ל. הוסף DMEM/F12 לנפח סופי של 10 מ”ל לכל חרוטי וצנטריפוגה ב-200 x גרם למשך 3 דקות כדי להדוף את הספרואידים. שאפו את הסופרנאטנט והוסיפו 1 מ”ל של 0.05% טריפסין (37 מעלות צלזיוס) עבור כל טיפה ראשונית המנותקת (למשל, אם מתחילים עם ארבע טיפות, הוסיפו 4 מ”ל טריפסין לבקבוקון החרוטי). דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, תוך טריטורציה תכופה (כל 2-3 דקות). העריכו באמצעות מיקרוסקופ האור כל כמה דקות. לאחר שהרוב (>90%) של הספרואידים נותקו לתאים בודדים, הוסיפו 10% סרום בקר עוברי (ב-DMEM/F12) ביחס נפח של 1:1 לטריפסין. סנן את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר וצנטריפוגה ב-300 x גרם למשך 5 דקות. בצע ספירת תאים ובצע החייאה שווה של התאים בצפיפות של 400 תאים/μL של מטריצה תלת-ממדית מופשרת. הימנעו מהכנסת בועות אוויר. יש לבצע שימוש חוזר במספר הטיפות הדרושות ליישום במורד הזרם. חזור על שלב 2.6-2.9 עבור כל באר. 4. הערכה וטיהור של NGFR+ iBC לאחר 10-14 ימים של המעבר האחרון, נתקו את הספרואידים לתרחיף של תא בודד כמו בשלבים 3.2-3.5 ובצעו ספירת תאים.הערה: קווי iPSC שונים מתנהגים אחרת; לכן, הטווח של 10-14 ימים עשוי להשתנות עבור iBC שונים. אנא עיין באיור 2 לקבלת הופעות אופייניות של תאי IBC תלת-ממדיים לאחר 1, 4, 8 ו-14 ימים, כאשר הם מתאימים למיון תאים מסוג NGFR+. מיון מוקדם מהמומלץ (לדוגמה, יום 8 כמו באיור 2C), גורם למספר תאים נמוך יותר באופן כללי עם ביטוי NGFR תכוף פחות. מיון מאוחר יותר מהמומלץ (למשל, יותר מ-14 יום לאחר המעבר האחרון) מוביל להישרדות לקויה של התאים לאחר המיון. בצעו החייאה של התאים בצפיפות של 1 x 106 תאים/100 μL ב-Sort Buffer (האוכלוסייה העיקרית). מעבירים אליקוט קטן (25-50 μL) לצינור נפרד (אוכלוסייה מינורית). הוסף נוגדן מצומד נגד NGFR (דילול 1:100) לאוכלוסיית התאים העיקרית. הוסף נוגדנים לבקרת איזוטיפ (דילול 1:200) לאוכלוסיית התאים הקטנים. הגנו על התאים מפני אור ושמרו על קרח במשך 30 דקות, לסירוגין (כל 5-10 דקות) תוך טריטורציה של התאים כדי למנוע תקיעת כדורים. לאחר 30 דקות, הוסף את מאגר המיון ביחס של 1:1 לכל צינור של תאים. תאי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט, נצלו מחדש את התאים המכוסים במאגר המיון בצפיפות של 10 x 106 תאים/מ”ל, והוסיפו כתם של תאים חיים או מתים. באמצעות אסטרטגיית NGFR+ gating מתאימה (המבוססת על בקרת איזוטיפ, ראו איור 3), מיין מספיק תאי NGFR+ חיים עבור יישומים נחוצים במורד הזרם.הערה: אם משתמשים ב-iBC עם כתבים פלואורסצנטיים (כלומר, NKX2-1GFP TP63tdTomato), מומלץ למיין עבור תאים “חיוביים משולשים” (כלומר, NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+, NGFR+), עם בחירת שערים מתאימה ופיצוי (איור 3). במהלך התפשטות זו של iBC, חלק מהתאים מתמיינים לתאים מפרישים וניתן לזהות גם חלק קטן מאוד של תאים רב-תאיים. שתי האוכלוסיות הללו הן NGFR-. 5. דור של תרבויות ALI ריריות הכן תוספות ממברנה נקבובית של 6.5 מ”מ על ידי הוספת מטריצה של 200 μL לתא האפי (מטריצה מוסמכת לתאי גזע עובריים אנושיים או למינין אנושי רקומביננטי-521) לפי הוראת היצרן. יש להניח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפחות לפני הצורך. שאפו את מטריצת הציפוי מהתא האפיקלי של התוספת. הוסף 500 μL של מדיום התא הבסיסי לתא הבזולטרלי. יש לבצע החייאה של לפחות 30,000 תאי NGFR+ ממוינים (משלב 4.5) ב-100-200 μL Basal Cell Medium ולהעביר לתא האפיקלי באמצעות מיקרופיפט P200. חזור על הפעולה עבור בארות רבות ככל הרצוי (ותאים זמינים). מניחים את הצלחת באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס. תוך 2-3 ימים, שאפו לתאים אפיקליים ובזולטראליים והזינו עם מדיום תאי בסיס טריים (500 μL עד apical, 100 μL עד basolateral). נטר את תא האפיקל מדי יום באמצעות מיקרוסקופיית אור. כאשר התאים נפגשים >80% (בדרך כלל 3-7 ימים), החליפו את מדיום תאי הבסיס בתווך התמיינות ALI (לא מחומם מראש) הן בתאים אפיקליים והן בתאים בזולטרליים. בעת עבודה עם ALI Differentiation Medium, הגן מפני אור על-ידי שמירה על מיכלי מדיה עטופים בנייר כסף ועל-ידי כיבוי אורות תקורה בעת הצורך. למחרת, שאפו את המדיום מהתא האפיקלי, ובכך חשפו את פני השטח האפיים לאוויר. החלף את מדיית ההבחנה הבינונית של ALI בתא הבזולטרלי כל 2-3 ימים. עקוב אחר הופעת התרבות כל 1-2 ימים. יש לשאוף בזהירות לכל נוזל שהצטבר מהתא האפיקלי, מבלי להפריע לשכבת התא. הערך את ההתנגדות החשמלית הטרנס-פיתלית (TEER) לשלמות אפיתל.הערה: ניתן להעריך את TEER בימים שלאחר החשיפה לאוויר כדי לתת קריאה של שלמות שכבת האפיתל. הזמן האידיאלי למדידת TEER לא נקבע, אם כי ערכים התואמים את ההבחנה הרירית באיכות גבוהה הם בדרך כלל >500 x cm2. אם יש צורך להסיר פסולת או ריר, להוסיף בעדינות 100 μL PBS (ללא Ca2+ או Mg2+) לתא apical. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן שאפו בזהירות ל-PBS. לאחר 7-10 ימים של חשיפה לאוויר, בדרך כלל מופיעים ריסונים תנועתיים וניתן לראותם באמצעות מיקרוסקופיית אור. בהתאם לניסוי המתוכנן ולקריאה, ניתן לנתח תאים לאחר 14-28 ימים של חשיפה לאוויר.הערה: אם נעשה שימוש בתאי כתב פלואורסצנטי, ואם קיים מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים, ניתן לעקוב אחר התאים באמצעות מיקרוסקופ אור וכן באמצעות פלואורסצנציה מדווחת. 6. שימור בהקפאה אופציונלית (אך מומלצת) של iBC לאחר 10-14 ימים של מעבר התרבית התלת-ממדית האחרון, נתקו את הספרואידים לתרחיף חד-תאי כמו בשלבים 3.2-3.5. בצע ספירת תאים. החייאה במדיום שימור בהקפאה בצפיפות של 250,000 תאים/500 μL בקריוביאל. מקם את cryovial(s) במיכל כדי להבטיח ירידה מתמדת בטמפרטורה (1 °C ( 1 ° C לדקה) ולהעביר ל – 80 ° C למשך 24 -48 שעות, ולאחר מכן העברה ל – 150 ° C לאחסון לטווח ארוך.הערה: בוצעו שימורים חוזרים בהקפאה, כמו גם שימור בהקפאה של תאים ממוינים מסוג NGFR+ בעבר, אך אלה לא הוערכו כראוי עבור כדאיות התאים והיכולת ליצור תרביות ALI פונקציונליות. במיוחד עם מעבר תאים מורחב, מומלץ להעריך עבור קריוטיפ כפי שצוין כי זה השתנה ב- iPSCs ותאים שמקורם ב- iPSC.