Генерация культур взаимодействия эпителиальных клеток дыхательных путей воздух-жидкость из плюрипотентных стволовых клеток человека

Каждый из следующих шагов должен быть выполнен с использованием стерильной техники в ламинарной вытяжке уровня биобезопасности 2. Все среды должны быть нагреты до комнатной температуры (22 °C) перед добавлением в ячейки, за исключением случаев, когда специально указано иное. Каждая стадия центрифугирования должна выполняться при комнатной температуре (приблизительно 22 °C). На рисунке 1 показаны схемы протокола. 1. Подготовка необходимых носителей ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительный файл 1 для получения дополнительной информации. Базально-клеточная среда Подготовьте базовую среду в соответствии с инструкциями производителя. К каждым 50 мл базовой среды добавляют 5 мкл A83-01 (10 мМ), 5 мкл DMH1 (10 мМ), 50 мкл Y-27632 (10 мМ) и 100 мкл Примоцина (50 мг/мл). В дальнейшем эта среда называется базально-клеточной средой. Хранить при температуре 4 °C до 1 месяца. Среда дифференциации ALI Подготовьте среду в соответствии с инструкциями производителя. К каждым 50 мл среды дифференцировки ALI добавляют 100 мкл примоцина (50 мг/мл). Хранить защищенным от света при температуре 4 °C в течение 1 месяца. Буфер сортировки На каждые 50 мл сортового буфера комбинируйте 47,5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса, 1 мл FBS, 200 мкл ЭДТА (500 мМ), 1,25 мл буфера HEPES (1 М), 50 мкл Y-27632 (10 мМ) и 100 мкл примоцина (50 мг/мл). Фильтр стерилизуют, используя размер пор 0,4 мкм. Хранить при температуре 4 °C до 1 месяца. Среда криоконсервации На каждые 50 мл криоконсервационной среды комбинируйте 45 мл базально-клеточной среды и 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Фильтр стерилизуют, используя размер пор 0,4 мкм. Хранить при температуре 4 °C до 1 месяца. 2. Размораживание криоконсервированных iBC Оттаивание (на льду) достаточного объема 3-D фактора роста с уменьшенным внеклеточным матриксом (далее 3-D матрица). Держите на льду до готовности к использованию.ПРИМЕЧАНИЕ: При размораживании одного флакона (содержащего 250 000 клеток) размораживают 100-200 мкл 3-D матрицы. Разморозьте флакон с ранее криоконсервированными одноклеточными суспензиями iBC путем инкубации в воде или бисерной ванне с температурой 37 °C до тех пор, пока не останется видимой замороженной среды (1-2 мин). Используя серологическую пипетку объемом 5 мл, добавьте клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл. Добавьте 6-10 мл DMEM/F12 по каплям в клеточную суспензию, аккуратно перемешайте и центрифугируйте при 300 х г в течение 5 мин, чтобы гранулировать клетки. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу в 1 мл базально-клеточной среды с помощью микропипетки P1000. Удалите аликвоту объемом 10 мкл и выполните подсчет клеток. Центрифугирование клеток при 300 х г в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки с плотностью 4000 клеток/мкл в ранее размороженной 3-D матрице с микропипеткой P1000.ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно избегать добавления пузырьков в 3-D матрицу. Пипетка матрицы медленно и осторожно. С помощью микропипетки P200 добавьте одну каплю (25 или 50 мкл) к основанию каждой лунки 12-луночной пластины, обработанной культурой ткани. Если начать с 250 000 замороженных клеток, ожидаемое количество капель на этом этапе составляет от 3 до 4 (25 мкл капель), в зависимости от жизнеспособности клеток. Инкубируйте пластину при 37 °C в течение приблизительно 15 мин, а затем добавляйте достаточно базальноклеточной среды в каждую лунку, чтобы полностью погрузить каплю (1,5 мл на 50 мкл; 1 мл на 25 мкл), используя серологическую пипетку 5 мл. Верните тарелку в увлажненный инкубатор. Подкармливайте клетки каждые 2 дня с использованием свежей базальной среды. Добавьте свежую среду в боковую часть лунки с серологической пипеткой 5 мл, следя за тем, чтобы не потревожить капли клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность клеток, покрытых на этой стадии, в 10 раз выше, чем обычная пассажная обработка iBC в разделе 3. 3. Диссоциация сфероидов и расширение iBC в 3-D культуре Оттаивание (на льду) достаточного объема 3-D матрицы. Держите на льду до готовности к использованию.ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый объем 3D-матрицы зависит от того, сколько ячеек потребуется пользователю. Примерно через 5-7 дней аспирируйте среду из каждой лунки и с помощью микропипетки P1000 добавьте 1 мл Диспазы II (1 ЕД/мл) непосредственно на сфероиды, чтобы диссоциировать из капель матрицы. Поместите пластину в инкубатор при температуре 37 °C на 10-15 мин. Используя микропипетку P1000, пипетку Dispase вверх и вниз 1-2 раза, разбивая большие комки 3-D матрицы. Верните пластину до 37 °C еще на 30-40 мин, позволив матрице полностью раствориться. Когда капля 3-D матрицы больше не видна под световым микроскопом, добавьте свободно плавающие сфероиды к конической конической матрице объемом 15 мл с помощью серологического наконечника пипетки объемом 5 мл. Добавьте DMEM/F12 для конечного объема 10 мл на коническую часть и центрифугу при 200 х г в течение 3 мин, чтобы гранулировать сфероиды. Аспирировать супернатант и добавить 1 мл 0,05% трипсина (37 °C) на каждую начальную диссоциированную каплю (например, если вы начинаете с четырех капель, добавьте 4 мл трипсина в коническую колбу). Инкубировать при 37 °C, часто тритурируя (каждые 2-3 мин). Оценивайте с помощью светового микроскопа каждые несколько минут. После того, как большинство (>90%) сфероидов были диссоциированы на отдельные клетки, добавьте 10% фетальной бычьей сыворотки (в DMEM / F12) в объемном соотношении 1: 1 к трипсину. Фильтруйте клетки через 40-мкм клеточный сетчатый фильтр и центрифугу при 300 х г в течение 5 мин. Выполните подсчет клеток и равномерно повторно суспендируйте клетки при плотности 400 клеток/мкл размороженной 3-D матрицы. Избегайте введения пузырьков воздуха. Повторно суспендируйте столько капель, сколько необходимо для последующего применения. Повторите шаг 2.6-2.9 для каждой скважины. 4. Оценка и очистка NGFR+ iBC Через 10-14 дней после последнего прохождения диссоциируют сфероиды на одноклеточную суспензию, как на шагах 3,2-3,5, и выполните подсчет клеток.ПРИМЕЧАНИЕ: Различные линии iPSC ведут себя по-разному; поэтому диапазон в 10-14 дней может варьироваться для разных иБК. Пожалуйста, обратитесь к рисунку 2 для типичных появлений 3-D iBC через 1, 4, 8 и 14 дней, когда они достаточны для сортировки клеток NGFR+. Сортировка раньше, чем рекомендуется (например, день 8, как показано на рисунке 2C), приводит к общему снижению числа клеток с менее частой экспрессией NGFR. Сортировка позже, чем рекомендуется (например, более чем через 14 дней после последнего прохождения) приводит к плохой выживаемости клеток после сортировки. Повторное суспендирование клеток при плотности 1 х 106 клеток/100 мкл в буфере сортировки (основная популяция). Переложите небольшую аликвоту (25-50 мкл) в отдельную трубку (незначительную популяцию). Добавьте конъюгированное анти-NGFR антитело (разведение 1:100) к основной клеточной популяции. Добавьте контрольные антитела изотипа (разведение 1:200) к популяции второстепенных клеток. Защитите клетки от света и держите на льду в течение 30 минут, периодически (каждые 5-10 минут) тритурируя клетки, чтобы предотвратить гранулирование. Через 30 минут добавьте буфер сортировки в соотношении 1:1 к каждой пробирке ячеек. Центрифужные ячейки при 300 х г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатант, повторно суспендируйте гранулированные клетки в буфере сортировки с плотностью 10 х 106 клеток / мл и добавьте пятно живых или мертвых клеток. Используя соответствующую стратегию NGFR+ (основанную на контроле изотипов, см. Рисунок 3), отсортируйте достаточное количество живых ячеек NGFR+ для необходимых последующих приложений.ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании iBC с флуоресцентными репортерами (т.е. NKX2-1GFP TP63tdTomato) рекомендуется сортировать по «тройным положительным» ячейкам (т.е. NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+, NGFR+), с соответствующим выбором и компенсацией затвора (рисунок 3). Во время этого расширения iBC часть клеток дифференцируется в секреторные клетки, и также может быть обнаружена очень небольшая доля мультицилиалированных клеток. Обе эти популяции являются NGFR-. 5. Генерация мукоцилиарных КУЛЬТУР АЛИ Подготовьте 6,5 мм пористые мембранные вставки путем добавления матрицы объемом 200 мкл в апикальную камеру (матрица, сертифицированная по эмбриональным стволовым клеткам человека, или рекомбинантный человеческий ламинин-521) в соответствии с инструкцией производителя. Поместите при температуре 37 °C не менее чем за 2 ч до необходимости. Аспирируйте матрицу покрытия из апикальной камеры вставки. Добавьте 500 мкл базально-клеточной среды в базолатеральную камеру. Повторно суспендировать по меньшей мере 30 000 отсортированных клеток NGFR+ (со стадии 4,5) в 100-200 мкл базально-клеточной среде и перенести в апикальную камеру с использованием микропипетки P200. Повторите для любого количества скважин (и доступных ячеек). Поместите пластину в увлажненный инкубатор при температуре 37 °C. Через 2-3 дня аспирируют аспиральную и базолатеральную камеры и кормят свежей базально-клеточной средой (500 мкл до апикальной, 100 мкл до базолатеральной). Ежедневно контролируйте апикальную камеру с помощью световой микроскопии. Когда клетки >80% сливаются (обычно 3-7 дней), замените базально-клеточную среду на среду дифференцировки ALI (не предварительно нагретую) как в апикальной, так и в базолатеральной камерах. При работе с ALI Differentiation Medium защитите от света, сохраняя контейнеры для носителей, обернутые в фольгу, и выключая верхний свет, когда это возможно. На следующий день аспирируйте среду из апикальной камеры, тем самым подвергая апикальную поверхность воздействию воздуха. Заменяйте среду дифференцировки ALI в базолатеральной камере каждые 2-3 дня. Следите за внешним видом культуры каждые 1-2 дня. Осторожно аспирируйте любую скопившуюся жидкость из апикальной камеры, не нарушая клеточный слой. Оцените трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) для целостности эпителия.ПРИМЕЧАНИЕ: TEER может быть оценен в дни после воздействия воздуха, чтобы дать показания целостности эпителиального слоя. Идеальное время для измерения TEER не установлено, хотя значения, согласующиеся с высококачественной мукоцилиарной дифференциацией, обычно составляют >500 хсм2. Если необходимо удалить мусор или слизь, осторожно добавьте 100 мкл PBS (без Ca2+ или Mg2+) в апикальную камеру. Инкубировать при 37 °C в течение 10 мин, а затем тщательно аспирировать PBS. После 7-10 дней воздействия воздуха обычно появляются подвижные реснички, которые можно увидеть с помощью световой микроскопии. В зависимости от запланированного эксперимента и считывания, клетки могут быть проанализированы после 14-28 дней воздействия воздуха.ПРИМЕЧАНИЕ: Если были использованы флуоресцентные репортерные клетки и если доступен флуоресцентный микроскоп с живыми клетками, клетки можно отслеживать с помощью световой микроскопии, а также репортерной флуоресценции. 6. Необязательная (но рекомендуемая) криоконсервация iBC Через 10-14 дней последнего прохождения 3-D культуры диссоциируют сфероиды на одноклеточную суспензию, как на этапах 3,2-3,5. Выполните подсчет ячеек. Повторное суспендирование в криоконсервационной среде при плотности 250 000 клеток/500 мкл в криовиале. Поместите криовиал (криовиалы) в контейнер для обеспечения устойчивого падения температуры (1 °C/мин) и переведите до -80 °C в течение 24-48 ч с последующим переносом до -150 °C для длительного хранения.ПРИМЕЧАНИЕ: Повторная криоконсервация, а также криоконсервация ранее отсортированных клеток NGFR+, были выполнены, но они не были адекватно оценены на жизнеспособность клеток и способность образовывать функциональные культуры ALI. Особенно при расширенном прохождении клеток рекомендуется оценивать кариотип, поскольку было отмечено, что он варьируется в IPSCs и клетках, полученных из iPSC.