Generatie van luchtwegepitheelcel lucht-vloeistof interfaceculturen uit menselijke pluripotente stamcellen

Elk van de volgende stappen moet worden uitgevoerd met behulp van steriele techniek in een bioveiligheidsniveau 2 laminaire stromingskap. Alle media moeten worden opgewarmd tot kamertemperatuur (22 °C) voordat ze aan cellen worden toegevoegd, tenzij specifiek anders vermeld. Elke centrifugatiestap moet worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (ongeveer 22 °C). Figuur 1 schetst de schema’s van het protocol. 1. Voorbereiding van de vereiste media OPMERKING: Zie aanvullend dossier 1 voor meer informatie. Basaal cel medium Bereid het basismedium voor volgens de instructies van de fabrikant. Voeg aan elke 50 ml van het basismedium 5 μL A83-01 (10 mM), 5 μL DMH1 (10 mM), 50 μL Y-27632 (10mM) en 100 μL Primocin (50 mg/ml) toe. Hierna wordt dit medium basaal celmedium genoemd. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand. ALI Differentiatie Medium Bereid het medium volgens de instructies van de fabrikant. Voeg aan elke 50 ml ALI Differentiation Medium 100 μL Primocin (50 mg/ml) toe. Bewaar beschermd tegen licht bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand. Sorteerbuffer Combineer voor elke 50 ml sorteerbuffer 47,5 ml Hanks’ Balanced Salt Solution, 1 ml FBS, 200 μL EDTA (500 mM), 1,25 ml HEPES-buffer (1 M), 50 μL Y-27632 (10 mM) en 100 μL Primocin (50 mg/ml). Filter steriliseren met een poriegrootte van 0,4 μm. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand. Cryopreservatie Medium Combineer voor elke 50 ml cryopreservatiemedium 45 ml basaalcelmedium en 5 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Filter steriliseren met een poriegrootte van 0,4 μm. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 1 maand. 2. Ontdooien van gecryopreserveerde iBC’s Ontdooien (op ijs) een voldoende volume van 3D-groeifactor verminderde extracellulaire matrix (hierna 3D-matrix). Houd op ijs tot het klaar is voor gebruik.OPMERKING: Ontdooi bij het ontdooien van één injectieflacon (met 250.000 cellen) 100-200 μL 3D-matrix. Ontdooi een injectieflacon met eerder gecryopreserveerde eencellige suspensies van iBC’s door te broeden in een water- of kralenbad van 37 °C totdat er geen zichtbare bevroren media zijn (1-2 min). Gebruik een serologische pipet van 5 ml om de celsuspensie toe te voegen aan een conische buis van 15 ml. Voeg 6-10 ml DMEM/F12 druppelsgewijs toe aan de celsuspensie, meng voorzichtig en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g om de cellen te pelleteren. Adem het supernatant aan en resuspendeer de celpellet in 1 ml Basal Cell Medium met een P1000 micropipette. Verwijder een aliquot van 10 μL en voer een celtelling uit. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min. Adem het supernatant op en resuspensieer de cellen met een dichtheid van 4.000 cellen/μL in eerder ontdooide 3D-matrix met een P1000-micropipette.OPMERKING: Het is van cruciaal belang om te voorkomen dat u bubbels toevoegt aan de 3D-matrix. Pipetteer de matrix langzaam en voorzichtig. Voeg met een P200-micropipette één druppel (25 of 50 μL) toe aan de basis van elk putje van een met 12 bronnen behandelde weefselkweekplaat. Als het begint met 250.000 bevroren cellen, ligt het verwachte aantal druppels in deze stap tussen 3-4 (25 μL druppels), afhankelijk van de levensvatbaarheid van de cel. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende ongeveer 15 minuten en voeg vervolgens voldoende basaal celmedium toe aan elke put om de druppel volledig onder te dompelen (1,5 ml voor 50 μL; 1 ml voor 25 μL), met behulp van een serologische pipet van 5 ml. Breng de plaat terug naar een bevochtigde incubator. Voer cellen om de 2 dagen met behulp van vers Basal Cell Medium. Voeg vers medium toe aan de zijkant van de put met een serologische pipet van 5 ml en zorg ervoor dat de druppel van cellen niet wordt verstoord.OPMERKING: De dichtheid van cellen die in deze fase worden geplateerd, is 10 keer hoger dan de routinematige passaging van iBC’s in rubriek 3. 3. Dissociatie van sferoïden en uitbreiding van iBC’s in 3D-cultuur Ontdooi (op ijs) een voldoende volume van 3D-matrix. Houd op ijs tot het klaar is voor gebruik.OPMERKING: Het vereiste volume van de 3D-matrix varieert afhankelijk van het aantal cellen dat de gebruiker nodig heeft. Ongeveer 5-7 dagen later, aspirateer het medium uit elke put en voeg met een P1000 micropipette 1 ml Dispase II (1 U / ml) rechtstreeks toe aan de sferoïden om te dissociëren van de druppel van de matrix. Plaats de plaat gedurende 10-15 min in de incubator van 37 °C. Pipetteer met behulp van een P1000-micropipette de Dispase 1-2 keer op en neer, waarbij grote klonten 3D-matrix worden gebroken. Breng de plaat terug naar 37 °C gedurende nog eens 30-40 minuten, zodat de matrix volledig kan oplossen. Wanneer de druppel van de 3D-matrix niet langer zichtbaar is onder de lichtmicroscoop, voegt u de vrij zwevende sferoïden toe aan een conische 15 ml met behulp van een serologische pipetpunt van 5 ml. Voeg DMEM/F12 toe voor een eindvolume van 10 ml per conisch en centrifugeer gedurende 3 minuten bij 200 x g om de sferoïden te pelleteren. Adem het supernatant aan en voeg 1 ml 0,05% trypsine (37 °C) toe voor elke initiële gedissocieerde druppel (voeg bijvoorbeeld, als het begint met vier druppels, 4 ml trypsine toe aan de erlenmeyer). Incubeer bij 37 °C en tritureer regelmatig (elke 2-3 min). Evalueer om de paar minuten met de lichtmicroscoop. Zodra de meerderheid (>90%) van de sferoïden is gedissocieerd aan enkele cellen, voegt u 10% foetaal runderserum (in DMEM / F12) toe aan een volumeverhouding van 1: 1 aan het trypsine. Filter de cellen door een celzeef van 40 μm en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g . Voer een celtelling uit en resuspensieer de cellen gelijkmatig met een dichtheid van 400 cellen / μL ontdooide 3D-matrix. Vermijd het introduceren van luchtbellen. Resuspendeer zoveel druppels als nodig is voor downstream-toepassing. Herhaal stap 2.6-2.9 voor elke put. 4. Evaluatie en zuivering van NGFR+ iBC’s Na 10-14 dagen van de meest recente passage, dissociëer de sferoïden tot een eencellige suspensie zoals in stap 3.2-3.5 en voer een celtelling uit.OPMERKING: Verschillende iPSC-lijnen gedragen zich anders; daarom kan het bereik van 10-14 dagen variëren voor verschillende iBC’s. Raadpleeg figuur 2 voor typische verschijningen van 3D-iBC’s na 1, 4, 8 en 14 dagen, wanneer ze geschikt zijn voor het sorteren van NGFR+-cellen. Eerder sorteren dan aanbevolen (bijv. dag 8 zoals in figuur 2C), resulteert in een algemeen lager celgetal met minder frequente NGFR-expressie. Later sorteren dan aanbevolen (bijvoorbeeld meer dan 14 dagen na de meest recente passage) leidt tot een slechte overleving van de post-sort cel. Resuspensieer de cellen met een dichtheid van 1 x 106 cellen/100 μL in Sorteerbuffer (hoofdpopulatie). Breng een kleine aliquot (25-50 μL) over naar een aparte buis (kleine populatie). Voeg geconjugeerd anti-NGFR-antilichaam (1:100 verdunning) toe aan de hoofdcelpopulatie. Voeg isotype controle antilichaam (1:200 verdunning) toe aan de kleine celpopulatie. Bescherm de cellen tegen licht en houd ze 30 minuten op ijs, met tussenpozen (elke 5-10 minuten) en tritureer de cellen om pelletvorming te voorkomen. Voeg na 30 minuten de sorteerbuffer in een verhouding van 1:1 toe aan elke buis cellen. Centrifugeer cellen bij 300 x g gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant, resuspendeer de gepelletiseerde cellen in de sorteerbuffer met een dichtheid van 10 x 106 cellen / ml en voeg levende of dode celkleuring toe. Gebruik de juiste NGFR+-gatingstrategie (gebaseerd op isotypecontrole, zie figuur 3) en sorteer voldoende levende NGFR+-cellen voor noodzakelijke downstream-toepassingen.OPMERKING: Als u iBC’s gebruikt met fluorescerende reporters (d.w.z. NKX2-1GFP TP63tdTomato), wordt het aanbevolen om te sorteren op “triple positive” cellen (d.w.z. NKX2-1GFP +, TP63tdTomato +, NGFR +), met de juiste poortselectie en compensatie (figuur 3). Tijdens deze uitbreiding van iBC’s differentieert een deel van de cellen in secretoire cellen en een zeer klein deel van de multiciliated cellen kan ook worden gedetecteerd. Beide populaties zijn NGFR-. 5. Generatie van mucociliaire ALI-culturen Bereid poreuze membraaninzetstukken van 6,5 mm voor door een matrix van 200 μL toe te voegen aan de apicale kamer (humane embryonale stamcel-gekwalificeerde matrix of recombinant humaan laminine-521) volgens de instructies van de fabrikant. Breng op 37 °C gedurende ten minste 2 uur voordat het nodig is. Zuig de coatingmatrix uit de apicale kamer van de insert. Voeg 500 μL van het basale celmedium toe aan de basolaterale kamer. Resuspensie ten minste 30.000 gesorteerde NGFR+ cellen (vanaf stap 4.5) in 100-200 μL Basal Cell Medium en breng over naar de apicale kamer met behulp van een P200 micropipette. Herhaal dit voor zoveel putten als gewenst (en beschikbare cellen). Plaats de plaat in een bevochtigde incubator van 37 °C. Aspirateer in 2-3 dagen apicale en basolaterale kamers en voer met vers basaal celmedium (500 μL tot apicale, 100 μL tot basolateraal). Controleer de apicale kamer dagelijks met lichtmicroscopie. Wanneer cellen >80% confluent zijn (meestal 3-7 dagen), vervang dan Basal Cell Medium door ALI Differentiation Medium (niet voorverwarmd) in zowel apicale als basolaterale kamers. Wanneer u met ALI Differentiation Medium werkt, bescherm dan tegen licht door mediacontainers in folie gewikkeld te houden en door de bovenlichten uit te schakelen wanneer dat mogelijk is. De volgende dag adem het medium uit de apicale kamer, waardoor het apicale oppervlak aan lucht wordt blootgesteld. Vervang de ALI Differentiation Medium media in de basolaterale kamer om de 2-3 dagen. Controleer het uiterlijk van de cultuur om de 1-2 dagen. Zuig zorgvuldig alle opgehoopte vloeistof uit de apicale kamer, zonder de cellaag te verstoren. Beoordeel de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) op epitheliale integriteit.OPMERKING: TEER kan worden beoordeeld in de dagen na blootstelling aan de lucht om een uitlezing van de integriteit van de epitheliale laag te geven. Het ideale moment om TEER te meten is niet vastgesteld, hoewel waarden die consistent zijn met hoogwaardige mucociliaire differentiatie meestal >500 x cm2 zijn. Als het nodig is om vuil of slijm te verwijderen, voeg dan voorzichtig 100 μL PBS (zonder Ca2+ of Mg2+) toe aan de apicale kamer. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten en adem pbs vervolgens voorzichtig op. Na 7-10 dagen blootstelling aan lucht verschijnen meestal beweeglijke trilharen en kunnen ze worden gezien met behulp van lichtmicroscopie. Afhankelijk van het geplande experiment en de uitlezing kunnen cellen worden geanalyseerd na 14-28 dagen blootstelling aan de lucht.OPMERKING: Als fluorescerende reportercellen zijn gebruikt en als er een fluorescerende microscoop met levende cellen beschikbaar is, kunnen cellen worden gevolgd met lichtmicroscopie en reporterfluorescentie. 6. Optionele (maar aanbevolen) cryopreservatie van iBC’s Na 10-14 dagen van de meest recente 3D-cultuurpassage dissociëren de sferoïden naar eencellige suspensie zoals in stap 3.2-3.5. Voer een celtelling uit. Resuspendatie in Cryopreservation Medium bij een dichtheid van 250.000 cellen/500 μL in een cryoviaal. Plaats cryoviale (en) in een container om een gestage temperatuurdaling (1 °C/min) te garanderen en breng gedurende 24-48 uur over naar -80 °C, gevolgd door overdracht tot -150 °C voor langdurige opslag.OPMERKING: Herhaalde cryopreservatie en cryopreservatie van eerder NGFR+ gesorteerde cellen zijn uitgevoerd, maar deze zijn niet voldoende beoordeeld op de levensvatbaarheid van cellen en het vermogen om functionele ALI-culturen te vormen. Vooral bij extended cell passaging wordt aanbevolen om te beoordelen op het karyotype, omdat is opgemerkt dat dit varieert in iPSC’s en iPSC-afgeleide cellen.