Generación de cultivos de interfaz aire-líquido de células epiteliales de las vías respiratorias a partir de células madre pluripotentes humanas

Cada uno de los siguientes pasos debe realizarse utilizando una técnica estéril en una campana de flujo laminar de nivel 2 de bioseguridad. Todos los medios deben calentarse a temperatura ambiente (22 °C) antes de agregarse a las celdas, excepto cuando se indique específicamente lo contrario. Cada paso de centrifugación debe realizarse a temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C). La figura 1 describe los esquemas del protocolo. 1. Preparación de los medios requeridos NOTA: Consulte el Archivo complementario 1 para obtener más información. Medio de células basales Prepare el medio base de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A cada 50 ml del medio base, agregue 5 μL de A83-01 (10 mM), 5 μL de DMH1 (10 mM), 50 μL de Y-27632 (10mM) y 100 μL de Primocina (50 mg/mL). En lo sucesivo, este medio se denomina medio de células basales. Conservar a 4 °C durante un máximo de 1 mes. Medio de diferenciación ALI Prepare el medio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por cada 50 ml de ali diferenciador medio, añadir 100 μL de primocina (50 mg/ml). Conservar protegido de la luz a 4 °C durante un máximo de 1 mes. Ordenar búfer Por cada 50 ml de tampón de clasificación, combine 47,5 ml de solución salina equilibrada de Hanks, 1 ml de FBS, 200 μL de EDTA (500 mM), 1,25 ml de tampón HEPES (1 M), 50 μL de Y-27632 (10 mM) y 100 μL de primocina (50 mg/ml). Esterilizar el filtro utilizando un tamaño de poro de 0,4 μm. Conservar a 4 °C durante un máximo de 1 mes. Medio de criopreservación Por cada 50 ml de medio de criopreservación, combine 45 ml de medio de células basales y 5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Esterilizar el filtro utilizando un tamaño de poro de 0,4 μm. Conservar a 4 °C durante un máximo de 1 mes. 2. Descongelación de iBC criopreservados Descongelar (sobre hielo) un volumen suficiente de factor de crecimiento 3-D reduce la matriz extracelular (en adelante matriz 3-D). Mantener en hielo hasta que esté listo para su uso.NOTA: Al descongelar un vial (que contiene 250.000 células), descongelar 100-200 μL de matriz 3D. Descongele un vial de suspensiones unicelulares de iBC previamente criopreservadas incubando en un baño de agua o perlas a 37 °C hasta que no haya medios congelados visibles (1-2 min). Usando una pipeta serológica de 5 ml, agregue suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. Agregue 6-10 ml de DMEM / F12 gota a gota a la suspensión celular, mezcle suavemente y centrífique a 300 x g durante 5 minutos para granular las células. Aspire el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 1 mL de Basal Cell Medium con una micropipeta P1000. Retire una alícuota de 10 μL y realice un recuento de células. Centrifugar las células a 300 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y resuspendir las células a una densidad de 4.000 células/μL en una matriz 3-D previamente descongelada con una micropipeta P1000.NOTA: Es fundamental evitar agregar burbujas a la matriz 3D. Pipetear la matriz lenta y cuidadosamente. Con una micropipeta P200, agregue una gota (25 o 50 μL) a la base de cada pocillo de una placa tratada con cultivo de tejido de 12 pocillos. Si se comienza con 250.000 células congeladas, el número esperado de gotas en este paso es de entre 3-4 (gotas de 25 μL), dependiendo de la viabilidad celular. Incubar la placa a 37 °C durante aproximadamente 15 min, y luego agregar suficiente Medio de Células Basales a cada pocillo para sumergir completamente la gota (1.5 mL para 50 μL; 1 mL para 25 μL), usando una pipeta serológica de 5 mL. Devuelva la placa a una incubadora humidificada. Alimente las células cada 2 días usando un medio de células basales fresco. Agregue medio fresco al costado del pozo con pipeta serológica de 5 ml, teniendo cuidado de no perturbar la gota de células.NOTA: La densidad de células chapadas en esta etapa es 10 veces mayor que la pasivación rutinaria de iBC en la sección 3. 3. Disociación de esferoides y expansión de iBCs en cultivo 3-D Descongelar (sobre hielo) un volumen suficiente de matriz 3D. Mantener en hielo hasta que esté listo para su uso.NOTA: El volumen de matriz 3D requerido variará según la cantidad de celdas que el usuario requerirá. Aproximadamente 5-7 días después, aspire el medio de cada pozo y con una micropipeta P1000, agregue 1 mL de Dispasa II (1 U / mL) directamente sobre los esferoides para disociarse de la gota de la matriz. Coloque la placa en una incubadora de 37 °C durante 10-15 min. Usando una micropipeta P1000, pipetee el Dispase hacia arriba y hacia abajo 1-2 veces, rompiendo grandes grupos de matriz 3D. Devuelva la placa a 37 °C durante 30-40 minutos adicionales, permitiendo que la matriz se disuelva por completo. Cuando la gota de la matriz 3D ya no sea visible bajo el microscopio de luz, agregue los esferoides que flotan libremente a una cónica de 15 ml utilizando una punta de pipeta serológica de 5 ml. Añadir DMEM/F12 para un volumen final de 10 mL por cónico y centrífuga a 200 x g durante 3 min para granular los esferoides. Aspire el sobrenadante y agregue 1 ml de tripsina al 0,05% (37 °C) por cada gota inicial disociada (por ejemplo, si comienza con cuatro gotas, agregue 4 ml de tripsina al matraz cónico). Incubar a 37 °C, triturando con frecuencia (cada 2-3 min). Evalúe con el microscopio de luz cada pocos minutos. Una vez que la mayoría (>90%) de los esferoides se han disociado a células individuales, agregue 10% de suero bovino fetal (en DMEM / F12) a una relación de volumen de 1: 1 a la tripsina. Filtre las células a través de un colador de células de 40 μm y centrífuga a 300 x g durante 5 min. Realice un recuento de células y resuspenda uniformemente las células a una densidad de 400 células/ μL de matriz 3D descongelada. Evite introducir burbujas de aire. Resusponga tantas gotas como sea necesario para la aplicación posterior. Repita el paso 2.6-2.9 para cada pozo. 4. Evaluación y purificación de NGFR+ iBCs Después de 10-14 días del paso más reciente, disocie los esferoides a una suspensión de una sola célula como en los pasos 3.2-3.5 y realice un recuento celular.NOTA: Las diferentes líneas iPSC se comportan de manera diferente; por lo tanto, el rango de 10-14 días puede variar para diferentes iBC. Consulte la Figura 2 para conocer las apariencias típicas de los iBC 3D después de 1, 4, 8 y 14 días, cuando son adecuados para la clasificación de células NGFR+. La clasificación antes de lo recomendado (por ejemplo, el día 8 como en la Figura 2C), da como resultado un número general de células más bajo con una expresión de NGFR menos frecuente. La clasificación más tarde de lo recomendado (por ejemplo, más de 14 días después del paso más reciente) conduce a una supervivencia celular posterior a la clasificación deficiente. Resuspendir las células a una densidad de 1 x 106 celdas/100 μL en Sort Buffer (población principal). Transfiera una pequeña alícuota (25-50 μL) a un tubo separado (población menor). Añadir anticuerpos conjugados anti-NGFR (dilución 1:100) a la población celular principal. Agregue anticuerpos de control de isotipos (dilución 1:200) a la población de células menores. Proteja las células de la luz y manténgalas en hielo durante 30 minutos, triturando intermitentemente (cada 5-10 minutos) las células para evitar la peletización. Después de 30 minutos, agregue el búfer de clasificación en una proporción de 1: 1 a cada tubo de celdas. Células centrífugas a 300 x g durante 5 min. Aspire el sobrenadante, resuspenda las células peletizadas en el Sort Buffer a una densidad de 10 x 106 células/ml, y agregue la tinción de células vivas o muertas. Utilizando la estrategia de cierre NGFR+ adecuada (basada en el control de isotipos, consulte la Figura 3), clasifique suficientes células NGFR+ vivas para las aplicaciones posteriores necesarias.NOTA: Si se utilizan iBC con reporteros fluorescentes (es decir, NKX2-1GFP TP63tdTomato), se recomienda clasificar las células “triple positivas” (es decir, NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+, NGFR+), con la selección y compensación de compuerta adecuadas (Figura 3). Durante esta expansión de iBCs, una proporción de células se diferencian en células secretoras y también se puede detectar una proporción muy pequeña de células multiciliadas. Ambas poblaciones son NGFR-. 5. Generación de cultivos mucociliarios ALI Prepare insertos de membrana porosa de 6,5 mm agregando una matriz de 200 μL a la cámara apical (matriz calificada para células madre embrionarias humanas o laminina-521 humana recombinante) según las instrucciones del fabricante. Colocar a 37 °C durante al menos 2 h antes de que sea necesario. Aspire la matriz de recubrimiento desde la cámara apical del inserto. Añadir 500 μL del medio de células basales a la cámara basolateral. Resusped al menos 30.000 células NGFR+ clasificadas (a partir del paso 4.5) en un medio de células basales de 100-200 μL y transferirlas a la cámara apical utilizando una micropipeta P200. Repita para tantos pozos como desee (y celdas disponibles). Coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 °C. En 2-3 días, aspirar cámaras apicales y basolaterales y alimentar con Medio basolateral fresco (500 μL a apical, 100 μL a basolateral). Monitoree la cámara apical diariamente con microscopía de luz. Cuando las células estén >80% confluentes (típicamente 3-7 días), reemplace el Medio de Células Basales con el Medio de Diferenciación ALI (no precalentado) en las cámaras apical y basolateral. Cuando trabaje con ALI Differentiation Medium, protéjase de la luz manteniendo los contenedores de medios envueltos en papel de aluminio y apagando las luces superiores cuando sea posible. Al día siguiente, aspire el medio desde la cámara apical, exponiendo así la superficie apical al aire. Reemplace el medio de diferenciación ALI en la cámara basolateral cada 2-3 días. Monitoree la apariencia del cultivo cada 1-2 días. Aspire cuidadosamente cualquier líquido acumulado de la cámara apical, sin perturbar la capa celular. Evaluar la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) para la integridad epitelial.NOTA: TEER se puede evaluar en los días posteriores a la exposición al aire para dar una lectura de la integridad de la capa epitelial. No se ha establecido el momento ideal para medir el TEER, aunque los valores consistentes con la diferenciación mucociliar de alta calidad suelen ser >500 x cm2. Si es necesario eliminar los desechos o el moco, agregue suavemente 100 μL PBS (sin Ca2+ o Mg2+) a la cámara apical. Incubar a 37 °C durante 10 min, y luego aspirar cuidadosamente PBS. Después de 7-10 días de exposición al aire, los cilios móviles suelen aparecer y se pueden ver usando microscopía de luz. Dependiendo del experimento planificado y la lectura, las células se pueden analizar después de 14-28 días de exposición al aire.NOTA: Si se han utilizado células reporteras fluorescentes, y si hay un microscopio fluorescente de células vivas disponible, las células se pueden rastrear con microscopía de luz, así como con fluorescencia de reportero. 6. Criopreservación opcional (pero recomendada) de iBCs Después de 10-14 días del paso de cultivo 3-D más reciente, disocie los esferoides a la suspensión unicelular como en los pasos 3.2-3.5. Realice un recuento de celdas. Resuspend en Medio de Criopreservación a una densidad de 250.000 células/500 μL en un criovial. Coloque los crioviales en un recipiente para garantizar una caída constante de la temperatura (1 ° C / min) y transfiera a -80 ° C durante 24-48 h, seguido de la transferencia a -150 ° C para el almacenamiento a largo plazo.NOTA: Se ha realizado una criopreservación repetida, así como la criopreservación de células previamente clasificadas con NGFR+, pero estas no se han evaluado adecuadamente para determinar la viabilidad celular y la capacidad de formar cultivos ALI funcionales. Especialmente con el pasaje celular prolongado, se recomienda evaluar el cariotipo, ya que se ha observado que varía en iPSC y células derivadas de iPSC.